多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中kisspeptin-kiss1r系統(tǒng)的表達(dá)及作用研究

1、    多囊卵巢綜合征大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)的表達(dá)及作用研究    劉冉冉 駱倩倩 孫曉娟摘要 目的 建立多囊卵巢綜合征（pcos）大鼠模型，探討卵巢組織中kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)表達(dá)及作用。 方法 孕10 d的wistar大鼠20只，其雌性后代60只，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為pcos組和正常組，每組30只。pcos組給予來曲唑和羧甲基纖維素（cmc）連續(xù)灌胃21 d，正常組給予等體積的cmc灌胃。造模結(jié)束后檢測兩組大鼠體重參數(shù)和血清激素水平;he染色檢測卵巢組織形態(tài)學(xué)改變;免疫組織化學(xué)染色和qrt-pcr檢測卵巢組織

2、中kisspeptin和kiss1r的表達(dá)。 結(jié)果 與正常組比較，pcos組大鼠的體重、腹膜后脂肪含量、卵巢重量均增加，血清黃體生成素、卵泡刺激素和睪酮水平均升高（p < 0.05或p < 0.01）。與正常組比較，pcos組大鼠卵巢中kiss1-mrna表達(dá)降低（p < 0.05）;兩組大鼠卵巢中kiss1r-mrna表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p > 0.05）。pcos組大鼠卵巢具有典型的多囊樣改變。 結(jié)論 pcos大鼠卵巢可見kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)的低表達(dá)，可能在pcos的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。關(guān)鍵詞 多囊卵巢綜合征;kisspeptin/ki

3、ss1r系統(tǒng);卵巢;來曲唑 r711.75           a           1673-7210（2020）07（a）-0016-04abstract objective to establish a rat model of polycystic ovary syndrome （pcos） and investigate the expression and function of kisspeptin/kiss1r system in ovarian tissue. methods

4、 twenty wistar rats at the 10th day of gestation were divided into pcos group and normal group according to the random number table method， with 30 rats in each group. in pcos group， letrozole and carboxy methyl cellulose （cmc） were administered continuously for 21 days， while in normal group， cmc o

5、f equal volume was administered. body weight parameters and serum hormone levels of two groups were measured after model establishment; the ovarian histomorphology was detected by he staining; the expression of kisspeptin and kiss1r in the ovarian tissue was detected by immunohistochemistry and qrt-

6、pcr. results compared with normal group， the weight， the content of retroperitoneal fat and the weight of ovary in pcos group were increased， and the levels of serum luteinizing hormone， follicle stimulating hormone and testosterone were increased （p < 0.05 or p < 0.01）. compared with normal g

7、roup， the expression of kiss1-mrna in the ovaries of pcos group was decreased （p < 0.05）. there was no significant difference in kiss1r-mrna expression between two groups （p > 0.05）. pcos group showed typical polycystic changes in ovaries. conclusion down-regulation of kisspeptin/kiss1r system

8、 in the ovaries of pcos rats may play an important role in the occurrence and development of pcos.key words polycystic ovarian syndrome; kisspeptin/kiss1r system; ovary; letrozole多囊卵巢綜合征（pcos）是臨床上最常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，多伴有卵泡發(fā)育異常和雄激素增多1，造成閉經(jīng)、不育、多毛、肥胖等2。由于發(fā)病率高，治療困難，增加腫瘤3的發(fā)生，pcos成為重要的研究課題。目前對pcos病因的研究較多，大多與下丘腦-垂

9、體-性腺軸有關(guān)。kisspeptin/kiss1受體（kiss1r）系統(tǒng)是此軸最強有力的影響因素4。kisspeptin是由kiss1基因編碼的神經(jīng)肽前體，可以結(jié)合并激活其受體kiss1r，并發(fā)揮作用。食源性肥胖大鼠下丘腦中的kisspeptin表達(dá)減少5，導(dǎo)致生殖障礙，營養(yǎng)不良、糖尿病等均會引起下丘腦kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)的異常表達(dá)6。在pcos大鼠中，下丘腦kiss1基因和kisspeptin表達(dá)均有顯著改變7-8。本研究主要探究kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在多囊卵巢中的作用，以了解其發(fā)病機制。1 材料與方法1.1 材料wistar大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限

10、公司，生產(chǎn)許可證號：scxk（魯）20190003，實驗設(shè)計和開展情況符合濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的倫理要求。病理圖像分析儀（萊卡）;rotor gene-3000pcr儀（德國qiagen）;酶聯(lián)免疫吸附測定（elisa）試劑盒上海酶聯(lián)生物，黃體生成素（lh）：002860;卵泡刺激素（fsh）：002872;睪酮（t）：003368;免疫組織化學(xué)染色試劑盒（bioworld，05100）;pcr試劑盒（roche，11636103001）。1.2 分組及模型制備孕10 d的wistar大鼠20只，產(chǎn)后60只雌鼠按160編號，依據(jù)隨機數(shù)字表法分為pcos組和正常組。pcos組30

11、只大鼠每日用來曲唑（1 mg/kg）溶于1%的羧甲基纖維素（cmc）溶液連續(xù)灌胃21 d;正常組30只大鼠給予等體積的cmc溶液灌胃。造模結(jié)束后，大鼠的激素改變、卵巢的典型多囊樣與臨床pcos患者一致，表明造模成功。1.3 動物取材造模結(jié)束后，稱重，測身長（鼻尖至肛門的距離），麻醉，心尖部取血，得血清備用;剝離腹膜后脂肪稱重;部分大鼠取新鮮卵巢組織;剩余大鼠用多聚甲醛心內(nèi)灌流固定卵巢組織，備用。1.4 elisa檢測血清激素水平按elisa試劑盒檢測血清lh、fsh和t水平。1.5 蘇木精-伊紅（he）染色檢測卵巢形態(tài)學(xué)改變將多聚甲醛固定后的卵巢，按照步驟，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、he染色等

12、一系列過程，觀察卵巢的形態(tài)學(xué)改變。1.6 免疫組織化學(xué)染色檢測卵巢中kisspeptin和kiss1r的表達(dá)將石蠟包埋的卵巢組織蠟塊，經(jīng)切片、脫蠟至水。一抗選用兔抗kisspeptin多克隆抗體，兔抗kiss1r多克隆抗體，二抗選用生物素化羊抗兔igg（1200），dab顯色，經(jīng)脫水、透明、封片、鏡檢。1.7 qrt-pcr檢測卵巢中kiss1-mrna和kiss1r-mrna的表達(dá)新鮮卵巢液氮研磨提取總rna，逆轉(zhuǎn)錄得cdna。制備-actin、kiss1和kiss1r引物序列。kiss1：上游5-cacctgtggtgaaccctgaa-3，下游5-gacgaat-ttgcacatgaag

13、tctcc-3;kiss1r：上游5-agcac-atgcagaccgtcacc-3，下游5-gacgaatttgc-acatgaagtctcc-3。預(yù)變性95×30 s，1個循環(huán);pcr反應(yīng)：95×5 s，60×20 s，40個循環(huán)。以-actin為內(nèi)參，采用rotor gene-3000進行擴增定量，以相對定量法分析數(shù)據(jù)。1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用spss 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗。以p < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 兩組大鼠體重參數(shù)和血清激素水平比較與正

14、常組比較，pcos組大鼠的體重、腹膜后脂肪含量、卵巢重量均增加（p < 0.05或p < 0.01），血清lh、fsh和t水平均升高（p < 0.05或p < 0.01）。見表1。2.2 兩組大鼠卵巢的形態(tài)學(xué)改變正常組大鼠卵巢可見多個卵泡，卵母細(xì)胞、透明帶和放射冠清晰可見，次級卵泡、成熟卵泡均正常;pcos組大鼠卵巢可見數(shù)十個囊狀擴張的卵泡，卵母細(xì)胞和放射冠減少或消失。見圖1。2.3 兩組大鼠卵巢中kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)的表達(dá)卵巢中kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)在胞質(zhì)中呈棕黃色著色，邊界清晰。kisspeptin主要表達(dá)于顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞，kis

15、s1r的陽性信號多見于顆粒細(xì)胞。分析顯示，與正常組比較，pcos組大鼠卵巢組織kisspeptin和kiss1r陽性細(xì)胞數(shù)量減少，胞質(zhì)著色淡，含量均減少。見圖2（封四）。2.4 兩組大鼠卵巢中kiss1-mrna和kiss1r-mrna的表達(dá)與正常組比較，pcos組大鼠卵巢中kiss1-mrna表達(dá)降低（p < 0.05）;兩組大鼠卵巢中kiss1r-mrna表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p > 0.05）。見圖3。3 討論pcos是無排卵性不孕的最常見原因，發(fā)病率為25%30%9，多見閉經(jīng)、多毛、肥胖、不孕和卵巢多囊樣改變。本實驗用來曲唑構(gòu)建大鼠的pcos模型，來曲唑可抑制芳香化酶

16、的功能，減弱睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)變成雌二醇和雌酮10的能力，導(dǎo)致雄激素水平升高。卵巢中高雄激素使卵泡發(fā)育停滯，無優(yōu)勢卵泡出現(xiàn)和持續(xù)性不排卵，是本課題中建立pcos模型的理論基礎(chǔ)。造模結(jié)束后，大鼠的體重、腹膜后脂肪和卵巢重量顯著增加，血清lh、fsh和t水平升高，he染色后可見卵巢結(jié)構(gòu)紊亂，呈典型的多囊樣，因此用來曲唑造?？梢宰鳛閜cos模型進行后續(xù)研究。pcos的致病機制尚不能確定，多與hpg軸的功能紊亂有關(guān)。kisspeptin是hpg軸最直接的啟動點11。營養(yǎng)不良12、禁食13、糖尿病14等均會引起下丘腦kiss1-mrna的表達(dá)減少。pcos大鼠的下丘腦kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)

17、中蛋白和基因表達(dá)有明顯改變，可能通過調(diào)節(jié)hpg軸的功能發(fā)揮作用。卵巢組織局部的kiss-peptin不僅在下丘腦發(fā)揮作用，而且還能調(diào)節(jié)卵巢的功能15。向體外培養(yǎng)卵巢黃體細(xì)胞加入外源性kissp-eptin，孕酮升高16，同時激活erkl/2信號途徑17，由此證明，kisspeptin可直接影響卵巢功能。pcos組大鼠卵巢組織中kisspeptin和kiss1r的低表達(dá)，可能導(dǎo)致卵泡的生長發(fā)育存在明顯缺陷18。kisspeptin處理黃素化的顆粒細(xì)胞后，促使顆粒細(xì)胞增殖分化，分泌雌激素和孕激素增加19。在pcos大鼠卵巢中，顆粒細(xì)胞數(shù)量減少或功能減低，可能與低表達(dá)的kisspeptin/kiss

18、1r系統(tǒng)有關(guān)。有研究將kisspeptin用于誘導(dǎo)排卵20，發(fā)現(xiàn)其能減少促排卵過程中卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生。綜上所述，kisspeptin/kiss1r系統(tǒng)與pcos的發(fā)生、發(fā)展存在潛在的聯(lián)系，為深入研究pcos的發(fā)病機制提供一定的理論基礎(chǔ)，并為臨床治療提供有利線索。參考文獻1  di pietro m，pascuali n，parborell f，et al. ovarian angiogenesis in polycystic ovary syndrome j. reproduction，2018，155（5）：r199-r209.2  王秋毅，黃薇.重視多囊卵巢綜合

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