細胞免疫熒光實驗步驟

1、細胞爬片免疫熒光實驗步驟第一天：1.在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗 3 次，每次 3min；2. 用 4%的多聚甲醛固定爬片 15min， PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 ) 室溫通透 20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；4. PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min ，吸水紙吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉 30min；5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4孵育過夜；第二天：6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3min，吸水紙吸干爬片上多

2、余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中 20-37 孵育 1h， PBST浸洗切片 3 次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。7. 復(fù)染核：滴加 DAPI避光孵育 5min，對標本進行染核， PBST 5min× 4 次洗去多余的 DAPI；8. 用吸水紙吸干爬片上的液體， 用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。細胞免疫熒光步驟1.在 24 孔板里加 500微升培養(yǎng)基，放爬片，接種細胞（做實驗以30-50% 匯合度較好。 10000-30000左右 2. 給藥處理 24h 。 3.PBS 洗三遍。4. 4 冷的多聚甲醛固定

3、15 分鐘，PBS 洗三遍，每次 5min ，搖床。（避光）Triton X 100（PBS 配）破膜 15min ，PBS 洗三遍，每次 5min ，搖床。 6.5%BSA（牛血清白蛋白， PBS 配）封閉 60 分鐘 ,不用洗。 7.加一抗孵育（ 5%BSA 配），4搖床過夜。8. 收集一抗，PBS 洗三遍，每次 5min ，搖床。孵育二抗 Alexa Fluor 488（1:1000 ）,1 / 3室溫 60min （避光）9. 回收二抗， PBS 洗三遍，搖床，每次 5min 。10. 0.5ug/mLDAPI （5%BSA 配， 2 滴/ml ）染核 15min 。（避光）11. P

4、BS 洗三遍，每次 5min ，搖床。12. 取載玻片，滴加 10uL 抗熒光衰減封片劑，將爬片有細胞面蓋在封片劑上，指甲油封片子的對角線。All steps for IF1) Remove culture medium and fix cells (a common fixative is 4% formaldehyde in PBS, for 15 minutes)2) Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical)3) Permeabilize the cells (a common permeabilization reagent is 0.2%

5、 Trito n X-100 in PBS for 30 minutes)4) Wash well in PBS5) (optional: Block for non-specific dye binding using the Image-iT FX Imag e Enhancer Solution, I36933)6) Block for non-specific antibody binding 30-60 minutes (a common blockin g solution would be 3-6% bovine serum albumin / 5% normal goat se

6、rum / PB S, or commercial blocking reagents like our BlockAid, product B10710)7) Incubate in primary antibody for 30-60 minutes, in blocking solution or ov ernight at 4 degrees (antibody concentrations vary, but usually between 0.5-1 0ug/mL)8) Wash well in PBS2 / 39) Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 3-6% bovine serum albumin / PBS (a good starting antibody concentration is 5 ug/mL) 10) Wash well in PBS11) Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306)12) Mount in appropriate mounting medium (for fluorescent secondaries, a go od antifade solution is best, such as Pro