一顱鎖骨發(fā)育不全綜合征家族的RUNX2基因分析研究

1、e    一顱鎖骨發(fā)育不全綜合征家族的runx2基因分析研究    姜濤 蔣序 張運(yùn)奎摘要 目的 檢測(cè)一個(gè)顱鎖骨發(fā)育不全綜合征（ccd）家系runx2基因突變情況。方法 采用先證者查證法，對(duì)ccd家系各成員進(jìn)行全身健康狀況及口腔專科檢查，拍攝x線片；抽取先證者及其父母、姐姐外周靜脈血，提取基因組dna，聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）擴(kuò)增runx2基因并測(cè)序，將先證者及其父母、姐姐runx2基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行blastn比較分析。結(jié)果 在先證者runx2基因的外顯子2上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)ct突變，此突變來自母系染色體該基因568位點(diǎn)的基因突變；密碼子cggtgg引起runx

2、2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第190位保守的精氨酸變成色氨酸，突變型為c.568c>t。結(jié)論 c.568c>t突變是導(dǎo)致該家系發(fā)病的分子基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 顱鎖骨發(fā)育不全綜合征； runx2； 基因突變 r 781.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 a doi 10.7518/hxkq.2013.05.019顱鎖骨發(fā)育不全綜合征（cleidocranial dyspla-sia，ccd）是一種累及骨骼和牙齒的常染色體顯性遺傳性疾病1，具有明顯的家族聚集性，男女發(fā)病率無明顯差別，臨床發(fā)病率約為1：1 000 000。ccd常見的臨床癥狀有囟門閉合延遲或不閉合，顱骨縫增寬，鎖骨鈣化不良、缺失或部分缺失，錐形胸，恥骨聯(lián)合增

3、寬而致骨盆發(fā)育不良，身材矮小等；口腔表現(xiàn)常見上頜骨發(fā)育不足，有多生牙，乳牙滯留，恒牙萌出延遲或埋伏牙等癥狀2-5。目前ccd的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，本研究采用分子生物學(xué)的方法對(duì)1個(gè)顱鎖骨發(fā)育不全家系的患者進(jìn)行runx2基因測(cè)序分析研究。1 材料和方法1.1 研究對(duì)象ccd家系1個(gè)，來自山東省濟(jì)南市，家系圖見圖1。先證者，女，29歲，2010年6月因“牙齒不齊，咀嚼困難”到濟(jì)南市口腔醫(yī)院修復(fù)科就診，要求修復(fù)上下牙列缺損。采用先證者查證法，對(duì)家系各成員進(jìn)行全身健康狀況及口腔專科檢查。查體：先證者反，混合牙列，恒牙僅16、17、26、27、36、37、46萌出，全部乳牙均滯留，1115、2125、313

4、5、4145未萌，65、71、72、73、75、81、82、83、85松動(dòng)度；顱骨和面部比例失調(diào)，頭大面小，前額及頂部突出呈方形，前囟門未閉合，從額部到枕部中線區(qū)有明顯凹陷；面中部發(fā)育不足，凹面型，眶距增寬；上頜骨及顴骨發(fā)育不足，下頜骨發(fā)育相對(duì)正常；肩部窄小，胸部呈圓錐形，鎖骨短小，僅在近胸骨處可捫及，雙肩下垂并可在胸前并攏。x線（圖2）檢查：上下頜骨內(nèi)有埋伏牙，滯留乳牙牙根未見明顯吸收，前囟門未閉合，顱縫增寬，并見多塊縫間骨，雙側(cè)肩胛骨較小，呈翼狀，位置下垂，雙側(cè)鎖骨肩峰端部分缺如，恥骨聯(lián)合間隙增寬，骶髂關(guān)節(jié)輕度增寬。先證者及其母親的臨床表現(xiàn)和x線特征均符合ccd特征。該家系中3代共15位成

5、員，其中ccd患者2例：先證者及其母親，其母親自述先證者姥姥、姥爺和其兄弟姐妹無類似癥狀。箭頭所指為先證者，代表代數(shù)。圖 1 患者家族譜系圖fig 1 the pedigree of the involved family1.2 基因組dna提取及測(cè)序1.2.1 dna提取 抽取先證者及其父母、姐姐外周靜脈血各2 ml，放入干冰凍存，使用universal ge-nomic dna extraction kit試劑盒進(jìn)行dna 提取，取 1 l進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得基因組dna。1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，pcr）擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)6的方法設(shè)計(jì)7

6、對(duì)寡核苷酸引物（表1），然后對(duì)runx2 基因分別使用takara la taq?、takara mightyamp dna polymerase?進(jìn)行套式pcr 擴(kuò)增，反應(yīng)體系及方法按照說明書進(jìn)行。1.2.3 基因測(cè)序及突變位點(diǎn)分析 使用takara aga-rose gel dna purification kit切膠回收目的片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由寶生物工程（大連）有限公司完成，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行blastn比較分析。2 結(jié)果將先證者的runx2基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行blastn比較分析，在exon 2上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)ct突變，實(shí)際測(cè)序圖譜顯示雙峰結(jié)構(gòu)（c、t）；對(duì)于其ccd母親的基因檢測(cè)結(jié)果表明，此突

7、變來自母系染色體該基因568位點(diǎn)的基因突變；密碼子cggtgg可能引起runx2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第190位（r190w）保守的精氨酸變成色氨酸。該突變型為c.568c>t，cgg>tgg。先證者的父親、姐姐的測(cè)序結(jié)果顯示，在同一位點(diǎn)顯示c的單峰，即與blastn中健康人的序列相同（圖3）。3 討論目前的研究表明，顱鎖骨發(fā)育不全的致病基因是runx2，該基因定位于染色體6p217-8，基因的錯(cuò)意表達(dá)、基因插入、缺失或者移碼突變等都是造成顱鎖骨發(fā)育不全綜合征的重要原因9。鎖骨顱骨發(fā)育不全呈常染色體顯性遺傳，有很高的外顯率和不同的表現(xiàn)型，輕癥僅有牙齒異常，嚴(yán)重者表現(xiàn)為全身骨質(zhì)受累2。本研究

8、家系中母女兩人受累，家系其他成員表型正常，考慮基因突變?yōu)橥话l(fā)性，突發(fā)后呈常染色體顯性遺傳。鎖骨顱骨發(fā)育不全的致病基因runx2是哺乳動(dòng)物編碼轉(zhuǎn)錄因子pebp2/cbf異二聚體d亞單位的3個(gè)基因之一，此亞單位包含了有結(jié)合dna能力的128個(gè)氨基酸殘基，并且這一結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中為保守區(qū)域，與果蠅的runt區(qū)域具有較高的同源性，因而得名6。研究發(fā)現(xiàn)runx2基因敲除小鼠模型沒有骨組織和成骨細(xì)胞，這表明該轉(zhuǎn)錄因子為成骨細(xì)胞分化所必需，其在維持正常的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用10-11。runx2基因突變存在熱點(diǎn)區(qū)域，該基因外顯子1、2、3、5、7編碼蛋白質(zhì)的3個(gè)重要功能域：谷氨酸-丙氨酸富集區(qū)（qa功能

9、域）、runt功能域和脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸富集區(qū)（pst功能域）12-14。本研究檢測(cè)到的r190w突變發(fā)生在runx2中，位于runt功能域內(nèi)，這個(gè)堿基改變將導(dǎo)致位于runt 結(jié)構(gòu)域中第190 位保守的精氨酸編碼為色氨酸（r190w）。在runt區(qū)域中的精氨酸拉伸物對(duì)dna的結(jié)合有重要作用，因此，這個(gè)區(qū)域的破壞可以導(dǎo)致dna結(jié)合能力的喪失13，精氨酸側(cè)鏈?zhǔn)莇na結(jié)合的主要區(qū)域，當(dāng)被不同的疏水性的色氨酸代替后，干擾了runt區(qū)域的結(jié)構(gòu)，降低了dna的結(jié)合能力。2001年berg-witz等15首次報(bào)道了這個(gè)突變位點(diǎn)，本研究結(jié)果則進(jìn)一步證實(shí)了runx2中的r190w錯(cuò)義突變?yōu)閏cd的致病突變，

10、推測(cè)r190w（c.568c>t）為一個(gè)突變熱點(diǎn)。典型ccd一般根據(jù)患者的典型面容、咬合關(guān)系、x線片檢查以及全身情況即可診斷，x線檢查方法為確診本病的主要手段。由于ccd的x線征象具有特殊性，所以診斷并不困難，關(guān)鍵在于是否能想到本病。但對(duì)于輕癥特別是僅有牙齒萌出異?；颊叩呐R床診斷較困難，通過檢測(cè)runx2是否存在突變位點(diǎn)可以輔助診斷ccd。由于本病目前尚無確切有效的治療手段且外顯率高，即使檢測(cè)基因發(fā)現(xiàn)有突變位點(diǎn)也并無好的治療方法，因此ccd患者愿意進(jìn)行抽血基因檢測(cè)的比例很少。盡管目前已有8090個(gè)runx2不同的突變位點(diǎn)被報(bào)道，約500個(gè)獨(dú)立的ccd患者家族經(jīng)過突變檢測(cè)的篩選，但是此疾病

11、致病基因的篩選和驗(yàn)證分析工作仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，新基因位點(diǎn)的鑒定將保證進(jìn)一步的系統(tǒng)突變分析工作的開展，這可以為探討ccd致病機(jī)制的分子遺傳學(xué)機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。對(duì)于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ccd患者應(yīng)進(jìn)行遺傳咨詢，通過產(chǎn)前診斷及時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶有致病基因的胎兒16。目前對(duì)ccd并無確切有效的治療方法。對(duì)于處于生長(zhǎng)發(fā)育期的患者可以采用正畸的方法進(jìn)行治療，必要時(shí)拔除滯留乳牙，減小恒牙萌出的阻力，或者采用牽引的辦法幫助恒牙萌出；對(duì)于骨缺損導(dǎo)致的鼻梁塌陷等，可采用整形外科手術(shù)的方法進(jìn)行骨移植，恢復(fù)患者的容貌；對(duì)于缺失牙齒，可采用種植或活動(dòng)義齒等修復(fù)方法來進(jìn)行修復(fù)。總之，對(duì)于ccd患者需要多學(xué)科聯(lián)合修復(fù)治療，長(zhǎng)期的臨床效果尚需要進(jìn)

12、一步觀察。參考文獻(xiàn)1 mundlos s， otto f， mundlos c， et al. mutations involving the transcription factor cbfa1 cause cleidocranial dyspla-siaj. cell， 1997， 89（5）：773-779.2 mundlos s. cleidocranial dysplasia： clinical and molecu-lar geneticsj. j med genet， 1999， 36（3）：177-182.3 fernandez ba， siegel-bartelt j， he

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