分子標記在稻瘟病研究中的應(yīng)用

1、    分子標記在稻瘟病研究中的應(yīng)用    歐陽偉摘 要 稻瘟病屬于水稻種植中一種常見的病害，給水稻產(chǎn)量和質(zhì)量造成了較多的不利影響，因此，需要科研人員從分析生物學角度出發(fā)，應(yīng)用分子標記技術(shù)對發(fā)生稻瘟病水稻的抗瘟基因進行研究，借助于該種基因研制可以有效抵御稻瘟病的水稻品種，以此控制稻瘟病的發(fā)病率，實現(xiàn)水稻生產(chǎn)數(shù)量和品質(zhì)的提高?；诖?，對當前稻瘟病的發(fā)病原因、抗病基因的研究情況進行了概述，結(jié)合研究成果分析了分子標記的定義，種類，重點介紹了分子標記在稻瘟病研究中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞 稻瘟?。环肿訕擞?；基因；染色體；抗?。簊435.111 文獻標志碼：b doi：10

2、.19415/ki.1673-890x.2018.12.096水稻（oryza sativa l.）是全球最重要的一種糧食作物，世界上有超過1/3的人口以水稻為主糧。在我國，有65%的人口也是以水稻為主要口糧1。由病原菌magnaporthe grisea引起的稻瘟病是水稻最重要的病害之一，俗稱水稻癌癥。該病害嚴重制約水稻生產(chǎn)，在稻瘟病大爆發(fā)年份，發(fā)病重的區(qū)域可造成水稻減產(chǎn)，減產(chǎn)幅度可以達到40%50%，甚至絕產(chǎn)2，而且會影響稻米品質(zhì)。在水稻生產(chǎn)過程中，為了減少稻瘟病病害對于水稻的影響，常采用種植優(yōu)質(zhì)水稻品種、化學農(nóng)藥法等手段進行防治，但由于藥物使用量不合理、水稻種植環(huán)境惡化，導致稻瘟病變異速

3、度較快，應(yīng)用常規(guī)防治方法干預病菌效果不理想，水稻抗病菌能力嚴重下降，而且過量使用農(nóng)藥易導致環(huán)境污染問題3。根據(jù)目前的研究可知，抗病品種是防治稻瘟病最好的辦法。鑒定和發(fā)掘更多的抗瘟基因，并對之進一步定位克隆，通過多基因聚合，獲得持久的抗病品種，是現(xiàn)代育種家最直接的育種目標。1 稻瘟病的研究現(xiàn)狀1.1 稻瘟病抗性基因的定位與克隆20世紀80年代，日本學者kiyasawa等用經(jīng)典遺傳學的方法鑒定出8個位點上的14個主效顯性抗稻瘟病基因，包括pik位點的piks、pikp、pikh、pikm和pik，pita位點的pita和pita2，piz位點的piz和piz1，以及pii、pia、pish、pib

4、和pit等。隨著分子標記水平的不斷發(fā)展，稻瘟病抗性基因的定位及復制得到了較快發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)有87個抗稻瘟病基因，87個基因分布在除第3染色體上的其他11條染色體上，并有成簇分布的趨勢。其中，最大的3個基因簇分別位于水稻的第6、11、12染色體上。如第6染色體上已定位了14個抗性基因，第11染色體上定位了24個抗性基因，第12染色體上則已定位16個抗性基因。1.2 稻瘟病產(chǎn)生的原因稻孢菌（pyricularia oryae）屬于半知菌亞門，為水稻稻瘟病的主要病原菌。水稻感染稻孢菌后，會在水稻中進行分生孢子、附著孢、侵染性菌絲的產(chǎn)生與分裂等一系列的變化。其具體過程是：稻孢菌以菌絲體和分生孢子的形式在

5、稻草和稻谷上越冬，當?shù)诙隁鉁鼗厣?0 左右時候，遇降雨就會萌發(fā)累積分生孢子。孢子的萌發(fā)主要集中在在夜間12點至第二天早上6點。接觸到禾苗后，在合適的溫度、濕度下就會侵染禾苗，使禾苗產(chǎn)生病害。2 分子標記在稻瘟病研究中的應(yīng)用2.1 分子標記概述該種技術(shù)包括細胞學標記、分子標記、形態(tài)學標記、生物化學標記等遺傳標記形式，其中分子標記較其他方法優(yōu)點較多：1）核酸，不局限于基因是否表達，不需要分析組織或器官特異性，不受季節(jié)環(huán)境的限制；2）遍及全部基因組，數(shù)量豐富，標記的數(shù)量不受限制；3）自然存在大量的等位變異，高多態(tài)性；4）共顯性多，很容易鑒別出基因型與雜合基因性；5）檢測手段方便快捷，良好的重復性

6、；6）不影響目標形狀的表達，不關(guān)聯(lián)不良形狀。2.2 分子標記的不同類型分子標記包含的多態(tài)性標志類型較多，主要有隨機擴增多態(tài)性、簡單重復序列、擴增片段長度多態(tài)性、長度片段多態(tài)性、染色體或基因組原位雜交（gish），mrna差別顯示（mrna dd），代表性差異分析法（rda），任意引物pcr（ap-pcr），單引物擴增反映（spars）等。2.2.1 隨機擴增多態(tài)性技術(shù)（rapd）該技術(shù)使用時可以在聚合酶鏈式反應(yīng)（pcr）作用下，對物質(zhì)基因組的dna進行擴增，最終獲得pcr產(chǎn)物。該產(chǎn)物在生成過程中，dna片段應(yīng)用隨機引物來擴增，之后與模板結(jié)合方向互補存在，保證結(jié)合位點具有較短的結(jié)合位置。rapd

7、技術(shù)具有以下優(yōu)點：1）無須獲得序列信息即可進行dna片段的大量擴增；2）技術(shù)操作較為簡單，采集樣本數(shù)量少，技術(shù)應(yīng)用成本支出較少；3）樣本遺傳基因為顯性。但是，應(yīng)用該技術(shù)對樣本進行處理，易導致樣本中的純合子、雜合子無法被鑒別出來，堿基大小相同但是序列不同的片段，不能分開進行處理。2.2.2 簡單重復序列（ssrs）技術(shù)類型主要有（ac）n、（ga）n等，處于兩端的序列為單拷貝，在pcr下對隨機引物進行設(shè)計，在多次重復后，片段長度有著極大差異。技術(shù)在應(yīng)用時，操作難度較低，便于工作人員直接操作，樣本多態(tài)檢驗結(jié)果較為精確。水稻中含有數(shù)量龐大的簡單重復序列，因此該技術(shù)的應(yīng)用效果較好。在現(xiàn)階段的研究中，m

8、ccouch等人選擇樣本，進行了簡單重復序列引物的開發(fā)，樣本引物數(shù)量共計為2 414對，標記點位2 240個，經(jīng)過技術(shù)應(yīng)用樣本標記數(shù)量有2 740個，之后再對樣本進行遺傳多樣性、基因定位等分析可知有著良好的應(yīng)用價值。2.2.3 擴增片段長度多態(tài)性（aflps）與長度片段多態(tài)性（rflps）長度片段多態(tài)性屬于分子標記技術(shù)中最先被研究出的一種多態(tài)性標記形式，在遺傳連鎖領(lǐng)域中應(yīng)用較多。技術(shù)應(yīng)用時，可以直接破壞限制性內(nèi)切酶識別位點，使得酶切片段可以在同一區(qū)域生成。應(yīng)用特異性探針可以對存在差異的片段帶型進行檢測，遺傳片段以顯性遺傳形式來表示，不具有表型效應(yīng)，標記點在不同等位時，不會發(fā)生互相干擾情況。但此

9、法應(yīng)用的成本高，樣本采集數(shù)量多，檢測技術(shù)操作復雜，長時間進行同位素檢測，易對工作人員造成人身損害。因此可以在該技術(shù)應(yīng)用基礎(chǔ)上，聯(lián)合aflps技術(shù)來檢測。2.2.4 酶切擴增多態(tài)性序列（caps）技術(shù)原理為對限制性內(nèi)切酶識別位點進行檢測，待位點出現(xiàn)喪失、重新生成時，需要使用引物重新設(shè)計位點。具體流程：dna片段經(jīng)pcr實現(xiàn)多態(tài)性位點的擴增，產(chǎn)生的產(chǎn)物應(yīng)用限制性內(nèi)切酶進行消解處理，酶切片段的大小應(yīng)用電泳法來確定，該法多用來對樣本的基因型信息進行檢測。2.2.5 候選基因技術(shù)（同源序列）（rga）對植物的抗病基因進行克隆，獲得的產(chǎn)物中有蛋白激酶、核苷酸結(jié)合位點等結(jié)構(gòu)域，用于識別細胞信號、蛋白質(zhì)等物質(zhì)

10、，并對上述物質(zhì)進行傳導處理。在抗病基因克隆基礎(chǔ)上對dna片段進行擴增，得到的片段序列非常相似?？蒲腥藛T在對馬鈴薯的抗病基因產(chǎn)物的研究中，在原來基因上利用引物合成了rga片段。2.3 分子標記在稻瘟病研究中的應(yīng)用稻瘟病的研究中，使用分子標記技術(shù)可以促使水稻充分發(fā)揮出抗病作用，有助于研究人員對抗病基因進行克隆處理。在抗病基因以往的研究中，長度片段多態(tài)性利用率高，但隨著科學技術(shù)的發(fā)展，由于該技術(shù)存在檢驗操作難、結(jié)果得出時間長、檢驗費用和樣本數(shù)量多、適用范圍少等弊端，逐漸被簡單重復序列等技術(shù)所取代，極大地提高了抗病基因研究的效率和質(zhì)量，對于人體不會造成嚴重傷害，安全性高，在目前的植物疾病基因定位研究中

11、應(yīng)用廣泛。2.4 在水稻抗病基因育種中應(yīng)用分析標記技術(shù)為了提高水稻的種植質(zhì)量，減少稻瘟病大面積暴發(fā)給農(nóng)戶造成的經(jīng)濟損失，需要不斷推廣與應(yīng)用預防稻瘟病的水稻新品種培育方法。以往在品種培育時，多選擇目標性狀直接進行培育，獲得的水稻品種種植效果好，但品種培育數(shù)量較少，培育時間較長，該法的應(yīng)用效果不理想。因此水稻種植人員在育種時，可以學習分子生物的相關(guān)知識，了解分子標記技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品、植物培育時發(fā)揮的重要作用，依托該技術(shù)進行抗稻瘟病水稻的育種工作。在水稻育種中，使用該技術(shù)手段可以選擇水稻的隱性性狀，在作物生長期間可以在各個階段對dna片段進行檢驗，分析片段是否發(fā)生變異以及變異的程度，是否有利于多基因聚合

12、水稻的育種。該技術(shù)育種時的應(yīng)用價值高，對于育種的操作要求較低，樣本數(shù)量要求不多，成本可以得到有效控制，培育出的水稻新品種對于生長環(huán)境有著良好的適應(yīng)性。因此分子標記技術(shù)需要在水稻抗病育種中大量應(yīng)用，以此促進諸多水稻種植農(nóng)戶經(jīng)濟收益的提升。3 展望當今科技日益發(fā)展，特別是生物信息學領(lǐng)域更是迅猛發(fā)展。分子標記技術(shù)雖然開發(fā)的時間不長，但應(yīng)用范圍極廣。分子標記技術(shù)的廣泛應(yīng)用最重要的限制因子是成本和利益，雖然從表面來看，分子標記花費的成本較傳統(tǒng)形態(tài)學標記高，但隨著分子標記在遺傳學的廣泛應(yīng)用，各種標記分析技術(shù)已程序化而易于實施。分子生物學理論和技術(shù)的快速發(fā)展，必將不斷開發(fā)出成本低、信息量大、應(yīng)用范圍廣的分子標記技術(shù)。在稻瘟病研究領(lǐng)域，應(yīng)用分子標記來定位抗性基因已經(jīng)取得了顯著成績。但也存在一些不足，如稻瘟病抗性基因的定位群體與育種群體存在脫節(jié)，基因定位的成果難于直接應(yīng)用到育種研究上。在以后的研究中應(yīng)該加強：1）在稻瘟病定位研究中選用育種材料來構(gòu)建定位群體，縮短基礎(chǔ)研究與應(yīng)用研究的距離；2）開發(fā)更多實用簡單易操作的分子標記技術(shù)，進一步促進分子標記輔助育種在實踐中的