柱色譜分離實(shí)驗(yàn).PPT

1、1柱柱 色色 譜譜Column Chromatography2了了 解：解： 1. 柱色譜法分離有機(jī)物的原理。 2固定相和流動(dòng)相的選擇原則。掌掌 握：握： 1. 色譜柱的填充方法。 2柱色譜分離的基本操作。一、實(shí)一、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 目目 的的3色色 譜譜 法法 簡(jiǎn)簡(jiǎn) 介介 色譜法亦稱色層法，色譜法亦稱色層法，層析法等，是層析法等，是分離，純化分離，純化和鑒定和鑒定有機(jī)化合物的重要有機(jī)化合物的重要方法之一，還可方法之一，還可定量分析定量分析。 4色譜法分類色譜法分類固定相、流動(dòng)相的物理狀態(tài)固定相、流動(dòng)相的物理狀態(tài)操作形式操作形式分離原理分離原理液液固色譜法固色譜法氣氣固色譜法固色譜法氣氣液色譜法液色譜

2、法液液液色譜法液色譜法柱色譜法（柱色譜法（column chromatography）薄層色譜法（薄層色譜法（TLC）紙色譜法（紙色譜法（paper chromatographypaper chromatography）氣相色譜（氣相色譜（GCGC）高效液相色譜（高效液相色譜（HPLCHPLC）吸附色譜法吸附色譜法分配色譜法分配色譜法離子交換色譜法離子交換色譜法排阻色譜排阻色譜操作形式操作形式柱色譜法（柱色譜法（column chromatography）二、實(shí)二、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理56柱色譜分離示意圖柱色譜分離示意圖混合物混合物吸附劑吸附劑(固定相固定相)洗脫劑洗脫劑(流動(dòng)相流動(dòng)相)二、實(shí)

3、二、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理78二、實(shí)二、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 原原 理理吸附劑的性質(zhì)：吸附劑的性質(zhì)：均勻、均勻、表面積大、不反應(yīng)、表面積大、不反應(yīng)、吸附能力不同吸附能力不同化合物的結(jié)構(gòu)：化合物的結(jié)構(gòu)：化合化合物的吸附性和它們的物的吸附性和它們的極性成正比極性成正比洗脫劑的極性：洗脫劑的極性：溶解溶解度適中、不反應(yīng)、易度適中、不反應(yīng)、易獲取回收獲取回收影響分離效果主要因素影響分離效果主要因素9101112131415161718192021和和在氧化鋁柱子上若分離下列各組混合物，哪一個(gè)組分先被洗脫下來(lái)？22三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容裝柱裝柱加樣加樣洗脫洗脫收集收集鑒定鑒定干法：干法：10g 硅膠硅膠 +乙

4、醇乙醇先用乙醇先用乙醇 后用水后用水操作操作組分顏色組分顏色組分顏色組分顏色1mL樣品樣品加樣操作加樣操作0.5mL2乙醇洗滌乙醇洗滌 柱色譜操作柱色譜操作：實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 步步 驟驟:23 吸附劑裝填緊密，排除吸附劑裝填緊密，排除氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上端平整，無(wú)凹凸面，無(wú)斷層。端平整，無(wú)凹凸面，無(wú)斷層。u 干法裝柱干法裝柱u 濕法裝柱濕法裝柱裝裝 柱柱三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容24 裝柱時(shí)應(yīng)該注意均勻，不能有氣泡，裂縫，否則樣品可能順縫隙流動(dòng)而不吸附，影響樣品的分離，應(yīng)用質(zhì)軟的物體如吸耳球等輕輕敲擊柱身，促使吸附劑裝填緊密，排除氣泡。最終應(yīng)使吸附劑的上端平整，無(wú)凹凸

5、面25 樣品為液體，可直接加樣；樣品為固體，可選樣品為液體，可直接加樣；樣品為固體，可選擇合適溶劑溶解為液體再加樣。加樣時(shí)，要沿管擇合適溶劑溶解為液體再加樣。加樣時(shí)，要沿管壁慢慢加入至柱頂部，勿使壁慢慢加入至柱頂部，勿使樣品攪動(dòng)吸附劑表面樣品攪動(dòng)吸附劑表面。 加加 樣樣三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容26洗洗 脫脫 在柱頂不斷加入洗脫劑，使洗脫劑永遠(yuǎn)保持有適當(dāng)?shù)牧浚灰屜疵搫┍砻媪鞲?，使流?dòng)相流速適當(dāng)。三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容27洗脫時(shí)應(yīng)注意：（1）向柱內(nèi)加入95%乙醇溶液洗脫（可以通過(guò)注射器沿管壁或安裝滴液漏斗）在恒壓或加壓條件下進(jìn)行洗脫?？刂屏鞒鏊俣?滴/秒。逐漸出現(xiàn)色層帶分離。（2

6、）第一色層帶到達(dá)色譜柱底部時(shí)，立即用錐形瓶收集第一色層的溶液，直到其完全被洗出?！咀⒁狻肯疵摃r(shí)切勿使溶劑流干！（3）然后，改用水溶液作為洗脫劑，當(dāng)?shù)诙珜訋У竭_(dá)色譜柱底部時(shí)，立即收集第二色層的的溶液，直到其完全被洗出。（4）用量筒分別量取所分離出來(lái)的兩種溶液的體積后，倒入指定的回收瓶中。（5）分離結(jié)束后，應(yīng)先讓溶劑盡量流干，然后倒置，用吸耳球從活塞 向管內(nèi)擠壓空氣，將吸附劑從柱頂擠壓出。使用過(guò)的吸附劑倒入垃圾桶里。28 試樣有色試樣有色，在層析柱上可直接觀察。洗脫后，在層析柱上可直接觀察。洗脫后分別收集各個(gè)組分。分別收集各個(gè)組分。收收 集集 試樣無(wú)色，試樣無(wú)色，收集洗脫液時(shí)，多采用等份收收集洗

7、脫液時(shí)，多采用等份收集，每份洗脫劑的體積隨所用吸附劑的量及試樣集，每份洗脫劑的體積隨所用吸附劑的量及試樣的分離情況而定。收集的每份洗脫劑的體積越小，的分離情況而定。收集的每份洗脫劑的體積越小，分離效果越好。分離效果越好。三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容29三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容鑒鑒 定定 試樣有色試樣有色依據(jù)顏色直接鑒定依據(jù)顏色直接鑒定 試樣無(wú)色試樣無(wú)色可結(jié)合薄層色譜結(jié)果可結(jié)合薄層色譜結(jié)果30 玻砂防堵塞 裝柱需緊密 加壓不可大 溶劑勿流干四、注四、注 意意 事事 項(xiàng)項(xiàng)31色譜法在有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用:u分離混合物u精制提純化合物u利用比移值(Rf)鑒定化合物u跟蹤反應(yīng)進(jìn)程小小 結(jié)結(jié)32色譜

8、法的特點(diǎn):u分離效率高 復(fù)雜混合物,同系物,異構(gòu)體等。u靈敏度高 可以檢測(cè)出g g-1(10-6)級(jí)甚至ng g-1(10-9) 級(jí)的物質(zhì)量。u分析速度快 幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣分析。 小小 結(jié)結(jié)33柱色譜法分離甲基橙和甲基藍(lán)柱色譜法分離甲基橙和甲基藍(lán)34實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理甲基橙和亞甲基藍(lán)均為指示劑,它們的結(jié)構(gòu)式如下所示:甲基橙甲基橙亞甲基藍(lán)由于甲基橙和亞甲基藍(lán)的由于甲基橙和亞甲基藍(lán)的結(jié)構(gòu)不同結(jié)構(gòu)不同,極性不同極性不同,吸附劑對(duì)它們吸附劑對(duì)它們的吸附能力不同的吸附能力不同,洗脫劑對(duì)它們的解析速度也不同洗脫劑對(duì)它們的解析速度也不同,極性小、吸附能極性小、吸附能力弱力弱、解析速度快的解析

9、速度快的亞甲基藍(lán)先被洗脫下來(lái)亞甲基藍(lán)先被洗脫下來(lái)，而，而極性大、吸附能力強(qiáng)極性大、吸附能力強(qiáng)、解析速度慢的解析速度慢的甲基橙后被洗脫下來(lái)甲基橙后被洗脫下來(lái)，從而使兩種物質(zhì)得以分離。本實(shí)，從而使兩種物質(zhì)得以分離。本實(shí)驗(yàn)以硅膠為吸附劑，驗(yàn)以硅膠為吸附劑，95%乙醇作為洗脫劑，先洗出亞甲基藍(lán)，再用蒸乙醇作為洗脫劑，先洗出亞甲基藍(lán)，再用蒸餾水作洗脫劑把甲基橙洗脫下來(lái)。餾水作洗脫劑把甲基橙洗脫下來(lái)。35三、實(shí)三、實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 內(nèi)內(nèi) 容容裝柱裝柱加樣加樣洗脫洗脫收集收集鑒定鑒定干法：干法：10g 硅膠硅膠 +乙醇乙醇先用乙醇先用乙醇 后用水后用水操作操作組分顏色組分顏色組分顏色組分顏色1mL樣品樣品加樣操作加

10、樣操作0.5mL2乙醇洗滌乙醇洗滌 柱色譜操作柱色譜操作：實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 步步 驟驟:36儀器和試劑儀器和試劑 1.儀器錐形瓶、玻璃漏斗、色譜柱 2.試劑 柱層析硅膠、脫脂棉、乙醇（95%）甲 基橙、亞甲基藍(lán)。 H2O 95 %乙醇 = 1 1 (A 液) 0. 2mol L -1HCl 95 %乙醇 = 1 1 (B 液)37裝置圖裝置圖裝柱裝柱洗脫洗脫38實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟裝柱裝柱：1、裝色譜柱：（1）取一支色譜柱，在柱子的收縮部塞一小團(tuán)脫脂棉花將色譜柱垂 直固定在鐵架臺(tái)上。 (2) 關(guān)閉活塞，向柱中倒入蒸餾水（也是洗脫劑，至柱體積的 1/2） （3）填吸附劑：稱取10g 硅膠于小燒杯中 ,加入 15mL 蒸餾水 ,用玻 璃棒調(diào)好通過(guò)漏斗慢慢裝入玻璃柱, 使其逐漸沉入底 部。用洗耳球敲打柱身使硅膠裝填緊密，打開(kāi)活塞，用小錐型 瓶承接, 控制滴速為1 滴秒,裝完后在上面加一層脫脂棉（ ，操作時(shí)要注意吸附劑始終不能露出液面）。39實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）實(shí)驗(yàn)步驟（續(xù)）加樣：加樣：當(dāng)液面剛好流至脫脂棉平面相切時(shí)，立刻關(guān)閉活塞， 加入 5mL左右的A 液 ,當(dāng)硅膠面又將要露出時(shí) ,關(guān)緊活塞 ,用量筒準(zhǔn)確加入 0. 50mL 以 A 液做溶劑的混合液(含甲基橙和亞甲基藍(lán)各為 0. 400 g L -1) 。 洗脫：洗脫：待此混合液將要滲入柱內(nèi)時(shí) ,立即用 A