hBMP2和hVEGF165雙基因修飾組織工程骨的構(gòu)建及檢測

1、hBMP2 和 hVEGF165 雙基因修飾組織工程骨的構(gòu)建及檢測范偉，張弓（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016 ）【摘要】目的：構(gòu)建 hBMP2 口 hVEGF16 雙基因修飾的組織工程骨并檢測其基因表 達情況。方法：構(gòu)建 pEGFP/hVEGFl65pEGFP/ hBMP 兩種真核表達質(zhì)粒，并用陽 離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至兔成骨細胞，再以脫蛋白骨（DPB 為支架，體外構(gòu)建多基因 修飾的組織工程骨，同時采用 RT-PCR 口 Western Blot 對組織工程骨中 hVEGF16 和 hBMP 基因的表達情況進行檢測。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染 hBMP2 口 hVEGF16 的成骨細胞可以在

2、DP 上貼附生長，并且兩種基因的體外表達時間可持續(xù)3 周左右。結(jié)論：成功構(gòu)建hBMP 和 hVEGF16 雙基因修飾組織工程骨，并且能有效表達 hBMP 和 hVEFGF16 基 因，為進一步觀察其在體內(nèi)的再血管化和成骨活性，用于大段骨缺損修復奠定了 實驗基礎?！娟P鍵詞】組織工程骨，血管內(nèi)皮細胞生長因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白，基因表達Construction and detection of dual-gene-modified tissue engineeringbone with the hBMP2 and hVEGF165FAN Wei， ZHANG-Gong（ Department of O

3、rthopaedics,the First Affiliated Hospital, ChongqingMedical University Chongqing ， 400016） Abstract Objective:Construction of dual-gene-modified tissue engineering with hBMP2 and hVEGF165， anddetection the gene expression of hVEGF165 and hBMP2. Method: This experiment is toconstruct two kind of euka

4、ryotic expression plasmid, pEGFP/hBMP2 andpEGFP/VEGF165, which were both transfected into osteoblasts , and then build adual-gene-modified tissue engineering bone in vitro with the Deproteinated Bone, DPB, asthe frame. At he same time, we detected the gene expression of hVEGF165 and hBMP2with RT-PCR

5、 and Western b l ot. Results: Osteoblasts transfected eukaryotic expressionplasmids of pEGFP/hBMP2 and pEGFP/VEGF165 could be growthed in DPB, and boththe hBMP2 and hVEGF165 could continue to express three weeksC.onclusion:ThehVEGF165 and hBMP2 dualgene- modified tissue engineering bone were constru

6、ctedsuccessfully, the genes of hVEGF165 and hBMP2 could be effective expressed in thistissue engineering bone, thus laying an experimental foundation for further observation ofits revascularization and bone formation in vivo and for the repair of large bone defect.【 Key words 】 Osteoblasts ， Tissu E

7、ngineering Bone， VEGF， BMP， GeneExpression骨骼組織因創(chuàng)傷、腫瘤、退行性改變等造成的骨缺損在臨床中十分常見，對 缺損的修復主要采用骨移植的方法進行治療?，F(xiàn)有治療手段均存在某些缺陷，組 織工程學技術為骨缺損修復提供了新的途徑。脫蛋白骨（ deproteinated bone ， DPB 具有天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，原骨鹽支架的三維結(jié)構(gòu)，其組成及結(jié)構(gòu)符合生理要 求，具有良好的組織相容性，有利于細胞的粘附生長與分化。本實驗通過構(gòu)建 hBMP 卻 hVEGF16 基因修飾的組織工程骨，為進一步觀察其在體內(nèi)的再血管化和 成骨活性，用于大段骨缺損修復奠定了實驗基礎。1材料

8、與方法1.1. 主要材料質(zhì)粒 plRES2-EGFP-hBM 及 pET22b-hVEGF16 均由華中農(nóng)業(yè)大學白培勝博士惠 贈。pEGFP-C 表達載體及大腸桿菌 DH5x 由重慶醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學實驗室保 存。健康成年新西蘭大白兔，雌雄不限，體重 2.303.20 kg , 15 只和臨產(chǎn)前 1 周 新西蘭大白兔 1只，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物實驗過程經(jīng)重慶醫(yī)科 大學倫理委員會審批同意。1 .2 主要試劑和設備30過氧化氫和乙醚 （重慶川東化工集團有限公司 ） ；環(huán)氧乙烷 （常州化學試劑廠） ;BglnKpnl、 EcoRI、 DNA maker DL2000 （TAKAR

9、A ; T4 DNA 連接酶、High FidelityPCR En zyme Mix（Ferme ntas）;質(zhì)粒抽提試劑盒、 DN 產(chǎn)物純化試劑盒（Promega ;陽離子脂質(zhì)體 Lipofectamine （Invitrogen ）； TRlzolRNA 提 取試劑盒 （GibeoBRL）；Omni script RT 試劑盒 （Qiage n）；TaqplusDNA 聚 合酶（promega） ;蛋白酶抑制劑、PVDFI（ Amershma-Pharmacia Biotech ） ； PC 儀（Bio-Rad）;高速低溫離心機（Beckman;全自動酶標儀（Anthos）;電泳儀（Bi

10、o-Rad） ;凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技）;DMEM（Sigam） Sansin 高速電動牙科 鉆；TC2323 型二氧化碳培養(yǎng)箱、OLYMPUS 光顯微鏡、X-650 型掃描電子顯微鏡（日 本） 。1.3 方法1.3.1 pEGFP/hVEGF165 pEGFP/hBMPt組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定1）pEGFP/hVEGF16 質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定：引物（由上海生工設計）上游：5CGGCAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCTTG 下游：5GATGGTACCTCACCGCCTCGGCTTGTCAET22-hVEGF16 為模板，按下列體系及條件行 PCR94C,預變性 2min；94C30s,

11、 60C30s, 72C45s , 30 個循環(huán)后 72C延伸 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，按 膠回收試劑盒步驟進行 PCF 產(chǎn)物回收，用 Kpn I 和 BglU分別酶切回收產(chǎn)物和 pEGFP-C 質(zhì)粒，37E反應 2 小時。回收酶切產(chǎn)物，加入 T4 連接酶進行連接反應， 16C過夜。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5a 感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)，挑取陽性菌 落，用質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒回收，-20C保存。重組質(zhì)粒的鑒定：PCF 鑒定、Kpn I 和 BglU雙酶切鑒定、測序鑒定（上海英駿生物技術有限公司）。2） pEGFP/hBMP 質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定： 用 EcoR I 和 BglU分

12、別酶切質(zhì)粒plRES2-EGFP-hBMP 和 pEGFP-C 質(zhì)粒，37C反應 2 小時。回收酶切產(chǎn)物，加入 T4 連接酶進行連接反應，16C過夜。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5x 感受態(tài)細胞 進行培養(yǎng)，挑取陽性菌落，用質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)?；厥?，-20C保存。重組質(zhì) 粒的鑒定：EcoRI 和BglU雙酶切鑒定、測序鑒定（上海英駿生物技術有限公司）。1.3.2 成骨細胞的培養(yǎng)與鑒定1） 成骨細胞的培養(yǎng)： 采用酶消化一組織塊聯(lián)合培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)出成骨細胞。無 菌操作下取臨產(chǎn)前 1 周新西蘭大白兔胎兔，取其顱骨頂部組織，浸泡于 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PBS）中。將骨組織反復沖洗后，加

13、入 0.2%I型膠原酶于室溫下消化后， 將骨塊剪碎至大小約 1 mmx 1 mm 勺小骨塊，均勻擺放于預先涂有胎牛血清的培養(yǎng) 瓶底部，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按 1： 2 比例傳代培養(yǎng)。2） 成骨細胞的鑒定： 在倒置相差顯微鏡下直接觀察原代培養(yǎng)細胞、傳代培養(yǎng)細胞 的生長情況及形態(tài)特點。 通過細胞化學鑒定 （鈣一鉆法堿性磷酸酶染色 ） 、 鈣化結(jié) 節(jié) Vonv Kossa染色等方法對培養(yǎng)的細胞進行觀察鑒定。1.3.3 pEGFP/hVEGF165 pEGFP/hBMP 體外轉(zhuǎn)染成骨細胞采用脂質(zhì)體法進行體外轉(zhuǎn)染，將 pEGFP/hVEGF165 pEGFP/ hBMP 重組質(zhì)粒 共同轉(zhuǎn)染至第 4 代培養(yǎng)

14、的胎兔成骨細胞。具體操作步驟按照 Lipofectamine 說明 書進行。未轉(zhuǎn)染的成骨細胞為對照組。48h 后用熒光顯微鏡觀察觀察轉(zhuǎn)染效果。1.3.4 脫蛋白骨支架制作 采用過氧化氫一乙醚法制作脫蛋白骨支架材料。用新鮮成年新西蘭大白兔脛骨上端、股骨下端和肱骨上端松質(zhì)骨，將其切割成 3mM4mmX15m 的骨條。將骨條經(jīng) 過氧化氫脫蛋白處理后，再用乙醚進行脫脂處理。將裝有凍干 DPB 勺塑料袋用環(huán)氧 乙烷密閉消毒 24h,置-20C冰箱備用。1.3.5組織工程骨的構(gòu)建及檢測1）成骨細胞與 DPB 體外復合培養(yǎng)：將 DPB 分為 2 組，實驗組（復合轉(zhuǎn)染pEGFP/hVEGF165pEGFP/h

15、BMP 的成骨細胞），對照組（復合未轉(zhuǎn)染的成骨細胞）。將細胞制成密度為 2Xl07/ml 的細胞懸液， 用微量移液器吸入 40 卩 1 （含成骨細胞 8X105個），緩慢、均勻地浸滴在預濕后的 DPB 材料上，可分次、小量浸滴，以懸 液不溢出支架為度。將接種細胞后的 DPB 材料小心放入 37C、飽和濕度、5%CO pH 7.2 孵箱中培養(yǎng)。2） RT-PCF 檢測 hBMP2ffi hVEGF165 勺 mRN 的表達：兩組細胞復合到 DPB進 行培養(yǎng)，于接種后 48 小時，隨機選取各組 2 個標本進行檢測。 引物設計： VEGF16：5上游 5 -TACTGCCATCCAATCGAGACC

16、 下游 5 -GCAAGTACGTTCGTTTAA3CTC-BMP2 上游 5 -CGAGCCAACACTGTGCGCAG，下游5 -CTTATCTGTGACCAGCTGTGT-B-actin :上游 5 -TCTTCCAGCCCTCCTTCCTG-下游 5 - CGTTTCTGCGCCGTTAGG提取細胞 總RNRT 反應條件： 42C反轉(zhuǎn)錄 40min, 99C滅活 5min。 PCF 反應條件：94C2min, 94E30s，57C30s，72C60s，30 個循環(huán)。取 RT-PCF 產(chǎn)物，進行瓊脂 糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下成像并觀察結(jié)果。3） Western Blot 檢測 hBM

17、P2 和 hVEGF165 蛋白的表達：兩組細胞接種到 DPB 上進行復合培養(yǎng)，分別選取接種后 1 日，3 日，7 日取標本進行檢測將胰酶消化 后的培養(yǎng)液冰上裂解，制備成細胞上清制備及蛋白電泳轉(zhuǎn)膜：取上述電泳后凝 膠，切膠后按次序與濾紙和 PVDF 膜層疊在一起，PVDF 為正極，放入電轉(zhuǎn)槽，4C，40V,過夜加入各自抗體進行免疫反應。化學發(fā)光，顯影，定影。2結(jié)果2.1 PCR 反應擴增 hVEGF165 cDNA以 pET22-hVEGF16 為模板的 PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示，在 500bp 與 750bp 之間可 見一明顯擴增條帶（圖 1）,與 hVEGF（約 647bp）大小相符。2.2

18、 pEGFP/hVEGF165 pEGFP/hBMP 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定及測序結(jié)果重組 pEGFP/hVEGF16 和 pEGFP/hBMP 質(zhì)粒經(jīng) BglU和 EcoR I 酶切，電泳后 可見 1、2 泳道各出現(xiàn)兩條片段（圖 2），大小分別與 pEGF（P4.7kb）、hBMP（21.2kb）和 hVEGF16 相符合，初步表明載體構(gòu)建成功。重組 pEGFP/hVEGF16 和pEGFP/hBMP 質(zhì)粒經(jīng)序列分析證實分別含有 hVEGF16 基因序列和 hBMP2 基因序列。進一步證實 pEGFP/hVEGF16 質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.3 成骨細胞的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果2.3.1 成骨細胞的觀察小骨

19、塊在培養(yǎng) 2 日 后, 即可見少量細胞從植塊邊緣爬出 , 并貼壁生長，其周 圍有部分小而圓的細胞。 5-7 日，細胞呈放射狀長出，細胞貼壁生長呈長梭形、 不規(guī)則形。培養(yǎng)1 0 日左右細胞基本長滿培養(yǎng)瓶壁 ,細胞相互匯合后呈明顯“鋪路 石”狀。隨著細胞傳代培養(yǎng)，圓形細胞逐漸減少。至第 4 代，細胞形態(tài)以梭形、三角形為主。胞核呈圓形或橢圓形，居中或偏于一側(cè)，輪廓清晰，呈集落樣生長 趨勢，集落中心細胞相互重疊（圖 3）。2.3.2ALP 染色肉眼觀察：在蓋玻片上生長的第 4 代細胞布滿黑褐色細小顆粒； 鏡下觀察： 第 4 代細胞質(zhì)被染成黑褐色 （圖 4）。2.3.3鈣化結(jié)節(jié) Von Kossa 染色

20、肉眼觀察：在蓋玻片上生長的第 4 代細胞可見散在的黑色結(jié)節(jié)；鏡下觀察： 可見較多黑褐色結(jié)節(jié)分布在細胞周圍 （圖 5）。2.5 熒光顯微鏡觀察第四代成骨細胞經(jīng)脂質(zhì)體法質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后 48h，熒光顯微鏡下可見空白轉(zhuǎn)染組 幾乎無綠色熒光（圖 6），轉(zhuǎn)染組存在較亮的綠色熒光（圖 7）。2.6 RT-PCR 檢測 hBMP2ffi hVEGF165 勺 mRNA 勺表達結(jié)果RT-PCF 結(jié)果表明（圖 8,9），轉(zhuǎn)染組的成骨細胞在復合 DPB48h 后都表達 hBMP2 和hVEGF16 的 mRNA 空白組未見明顯 hBMP2 和 hVEGF165 mRN 表達。表明構(gòu)建 的組織工程骨可以在體外表達 hBM

21、P2W hVEGF165 mRNA2.7 Western Blot 檢測結(jié)果Western Blot 結(jié)果表明 （圖 10, 11） ， 轉(zhuǎn)染組的成骨細胞在復合 DPB 1d 即 可見 hBMP和 hVEGF16 蛋白表達，至 7d 后轉(zhuǎn)染組還可以高表達兩種蛋白，空白 組未見明顯 hBMP和 hVEGF165 蛋白表達或有痕量表達。表明構(gòu)建的組織工程骨 可以在體外持續(xù)（7d）表達 hBMP 告口 hVEGF165 蛋白。3討論血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種特異性的作用血管內(nèi)皮細胞并促進血管內(nèi)皮細胞增殖的細胞因子， 它

22、與特異性受 體結(jié)合后，能強烈地促進血管內(nèi)皮的增殖， 刺激新生血管的形成。 另有研究表明， VEGF 可增加成骨細胞數(shù)量，促進骨組織形成，同時減少骨吸收 。因此，VEGF 基 因可以明顯加快組織工程骨的血管新生，促進骨缺損的修復2。骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (Bone morphogeneticprotein,BMP) 參與骨骼的生長、發(fā)育及創(chuàng)傷的修復 , 主要表 現(xiàn)為 BMP 勺誘導成骨作用。雖然 BMP2 單獨應用即有較強的誘導成骨活性，但骨 修復是一個復雜的受多種細胞因子調(diào)控的過程， 血管形成是其中非常重要的環(huán)節(jié)。 VEGF 是機體內(nèi)促進血管生長最重要的生長因子， 對軟骨內(nèi)成骨及骨折愈合過程中 的血

23、管增生發(fā)揮重要作用。VEGF 在由 BMP 介導的成骨過程中非常重要，它們可 以通過聯(lián)合方式促進骨的再生5。近幾年來，一些相關研究表明，在體外培養(yǎng)的 成骨細胞，骨髓細胞，間充質(zhì)細胞等細胞中，BMP 和 VEGF 可以相互促進表達，BMP 可對 VEGF 的表達起到正向調(diào)控作用。支架材料作為種子細胞和組織因子的載體， 是構(gòu)建組織工程骨的基本要素之 一。支架材料是細胞附著的基本框架和代謝場所， 其成分復雜， 影響著細胞生長、 分化等多種功能活動。本實驗采用的脫蛋白骨，是用過氧化氫乙醚法制得的天 然生物衍生骨支架材料，具有一定的強度和柔韌度，保存了原骨組織的孔徑、孔 隙率及孔間連接等天然孔網(wǎng)系統(tǒng)，

24、骨小梁結(jié)構(gòu)得以保持， 便于成骨細胞附著生長， 為成骨細胞增殖、分化、功能發(fā)揮、營養(yǎng)物質(zhì)的交換、周圍組織及血管的長入提 供寬大的內(nèi)部空間和表面積，從而發(fā)揮良好的傳導成骨作用7。經(jīng)對其理化特性 的檢測，該材料 pH 值為弱堿性，與體外構(gòu)建組織工程骨時的環(huán)境較一致， 且利于 鈣鹽的沉積；材料中蛋白質(zhì)含量甚微，在制備過程中經(jīng)脫脂處理，使其抗原性得 以基本消除8。采用環(huán)氧乙烷熏蒸法消毒，其揮發(fā)的環(huán)氧乙烷氣體可殺滅材料中 的細菌等微生物。該消毒法具有操作簡便、消毒徹底、便于保存等優(yōu)點。本實驗將重組質(zhì)粒 pEGFP/hBMP 和 pEGFP/hVEGF16 分別和共同轉(zhuǎn)染到胎兔 顱骨分離培養(yǎng)的成骨細胞中，構(gòu)

25、成組織工程骨中的種子細胞。再用DPB 支架材料與種子細胞在體外進行復合培養(yǎng)。 經(jīng)觀察，轉(zhuǎn)染 hVEGF16 和 hBMP2 基因的成骨細 胞在DPB均能有效的貼附、生長、增殖。而且 RT-PCR 和 Western Blot 檢測轉(zhuǎn) 染后的成骨細胞能在 DPB表達 hVEGF16 和 hBMP?說明成功在體外構(gòu)建了組織 工程骨，為以后修復骨缺損和加快成骨和血管化的體內(nèi)實驗奠定了基礎。參考文獻1Hall AP, Westwood FR, Wadsworth PF.Review of the effects of anti-angiogenic compounds on theepiphyseal

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