黎藥經(jīng)驗方的致突變試驗研究

1、    黎藥經(jīng)驗方的致突變試驗研究    周星+高香奇+符欣蕙【摘 要】 目的：考察黎藥經(jīng)驗方的遺傳毒性。方法：致突變試驗采用鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變試驗（ ames 試驗）、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗和小鼠精子畸型試驗等三項試驗。ames 試驗：設(shè)受試物5個劑量組（即5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿），另設(shè)未處理對照組、溶劑對照組和陽性對照組； 微核試驗：小鼠50只，雌雄各半，設(shè)10、5.0、2.5 g/kg·bw 劑量組，另設(shè)溶劑對照和陽性對照組； 精子畸型率試驗：昆明種小鼠雄性25只，分組同微核實驗，檢測精

2、子畸形率。結(jié)果：ames 試驗中，加或不加 s9 的情況下，受試物對ta97、ta98、ta100和ta102菌株均未顯示致突變作用。與溶劑對照組比較，高、中、低3個劑量的受試物組雄性、雌性小鼠微核試驗、小鼠精子畸變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。結(jié)論：綜合考慮前期試驗結(jié)果及相關(guān)研究，在本次實驗條件下，在一定劑量范圍內(nèi)，ames 試驗、 微核試驗和小鼠精子畸變試驗結(jié)果顯示陰性，認(rèn)為該黎藥經(jīng)驗方具有遺傳毒性的可能性較小?！娟P(guān)鍵詞】 驗方；黎族；致突變；遺傳毒性r29 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 a1007-8517（2016）24-0043-03abstract：objective to stud

3、y the mutagenesis caused by sproved recipe of the li.methods ames test test substance groups of 5.000 mg /dish，1.000，0.200，0.040 mg /dish and 0.008 mg /dish and three control groups（untreated，solvent and positive control） to detect the rechanged bacterium colonies.micronucleus test 50 samples of the

4、 kunming mice were randomly divided into positive control group，solvent control group and group of test substance 10.0g/kg，5.0g/kg，and 2.5g/kg.there were 10 in each group（male and female in half）.the micronucleus rate of bone marrow polychromatic erythrocyte were detected； sperm malformation rate te

5、st 25 samples of the kunming male mice， designed the groups as micronucleus test， were testing the rate of sperm abnormality.results comparing with control group，bone marrow cell micronucleus rate and sperm malformation rate of high，middle and low test substance groups of mice，what had no statistica

6、l significance（p>0.05）. compared with the untreated group，different doses of test substance ames strains from the back variables did not change significantly （p>0.05）. conclusion considering the preliminary test results and related research， under the conditions of this experiment and in the d

7、efinite dose range，the three test results above show negative results. there is little possibility that test substance of proved recipe from the li has mutagenesis.keywords：proved recipe；the li；mutagenesis； genetic toxicity本黎藥驗方中所含的主要有雞血藤、補血藤、七葉蓮、牛大力等藥材。該方為黎族民間的經(jīng)驗方，在黎醫(yī)指導(dǎo)下，用于調(diào)節(jié)婦女產(chǎn)后身體狀態(tài)并可促使其恢復(fù)體力。通過動物實

8、驗發(fā)現(xiàn)該方能顯著延緩小鼠游泳至力竭的時間，發(fā)現(xiàn)其具有較強的延緩疲勞的作用，能有效提高運動耐力，具有抗疲勞功效1。其中主要藥材雞血藤、牛大力等在南方民間食療療中具有歷史悠久。對牛大力的本草考證上發(fā)現(xiàn)其始載于生草藥性備要，是廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)（1990年版）收載的地方藥材2，補腰腎、強筋骨功效顯著3。雞血藤是一味活血化瘀中藥，能補血、活血、通絡(luò)；主治月經(jīng)不調(diào)、血虛萎黃、麻木癱瘓等4，藥理實驗研究表明有顯著的補血作用5。近年來，黎族驗方中常見藥材雞蛋花通過高內(nèi)涵體外微核實驗和ames實驗發(fā)現(xiàn)還具有較強的抗突變活性6。但民族藥物來源復(fù)雜，部分藥材還未收入地方藥材標(biāo)準(zhǔn)，故對其開展相關(guān)毒理學(xué)研究具有重要意義。

9、本研究按黎醫(yī)采用傳統(tǒng)煎煮工藝得到的湯劑作為受試物，以小鼠為實驗動物觀察該藥的致突變作用，旨在為黎族驗方的使用安全性評價提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料 1.1.1 受試物和試驗菌株 黎藥驗方受試物（以下簡稱“受試物”，藥材由五指山黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會提供，按其提供方法得水煎液并濃縮到一定濃度）；ames試驗用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型ta97、ta98、ta100、ta102菌株（海南省藥物研究所保存）。1.1.2 實驗動物 無特定病原體（spf）級km小鼠50只（2530g，雌、雄各半）、性成熟雄性km小鼠25只（3035g）海南省藥物研究所提供，生產(chǎn)許可證號：scxk（瓊）2015-00

10、07。動物于屏障系統(tǒng)動物實驗室飼養(yǎng)使用許可證號syxk（瓊）2014-0025，溫度為（24.0±1.5），濕度為（60±10）%，工作照度為200l300lx，人工照明、黑夜12h交替，噪音<60db，檢疫3d后進(jìn)行實驗。飼養(yǎng)環(huán)境和飼料標(biāo)準(zhǔn)均遵循國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)7-8。1.2 方法1.2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗（ames試驗） 采用平板滲入法對樣品進(jìn)行測試，分別在加與不加大鼠肝s9系統(tǒng)的條件下進(jìn)行試驗。鼠傷寒沙門菌突變菌株ta97、ta98、ta100和ta102經(jīng)鑒定符合要求。設(shè)5個劑量：5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿，使用

11、蒸餾水稀釋。同時設(shè)未處理對照組、溶劑對照和陽性對照組。在頂層培養(yǎng)基中加入0.1ml試驗菌株增菌液、0.1ml試驗用受試物溶液和0.5ml肝臟混合功能氧化酶（s9混合液），混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，每個劑量6個平皿；（37±1）培養(yǎng)48h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)9。1.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗 體重2530gkm小鼠50只，隨機(jī)分為5個組，每組10只，雌雄各半，以受試物對小鼠的急性經(jīng)口毒性試驗最大給藥量結(jié)果（10g/kg，以流浸膏計）為依據(jù)，試驗設(shè)受試物3個劑量組（即10、5.0、2.5g/kg·bw）、陽性對照組（灌胃40mg/kg環(huán)磷酰胺）、溶劑對照組（滅菌水），間隔2

12、4h，2次灌胃，給藥體積為0.2ml/10g，末次給予受試物6h后，取胸骨骨髓制片，每只動物觀察1000個嗜多染紅細(xì)胞（pce），計數(shù)含帶微核的細(xì)胞數(shù)，計算微核率（）。同時計數(shù)200個細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞（nce）比例10。1.2.3 小鼠精子畸形試驗 體重3035g雄性km小鼠25只，隨機(jī)分為5個組，每組5只，分別為受試物3個劑量組（即10、5.0、2.5g/kg·bw）、陽性對照組（灌胃40mg/kg環(huán)磷酰胺）、溶劑對照組（蒸餾水），每日灌胃1次，連續(xù)5d，末次灌胃30d后處死小鼠，取附睪制片，每只動物觀察計數(shù)1000個結(jié)構(gòu)完整的精子，計數(shù)畸形精子數(shù)，計算精子畸形率（%

13、）11。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用spss 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)采用（xtx-*3±s）表示，采用單因素方差分析，p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 受試物致突變作用 各菌株不同陽性對照回復(fù)突變菌落數(shù)均遠(yuǎn)超溶劑對照和未處理對照突變菌落數(shù)，表明試驗體系可靠。在檢測劑量范圍內(nèi)，加或者不加s9的情況下，受試物對4個菌株均未顯示誘變作用。見表1。2.2 受試物對小鼠骨髓pce微核率影響 與溶劑對照組比較，各劑量受試物組小鼠骨髓pce微核細(xì)胞率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）；與溶劑對照組比較，陽性對照組小鼠骨髓pce微核細(xì)胞率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

14、（p<0.05）；各組小鼠pce/nce比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。見表2。2.3 受試物對小鼠精子畸形率影響 溶劑對照組、受試物3個劑量組（即10、5、2.5g/kg）、陽性對照組小鼠精子畸形率分別為（0.95±0.35）%、（1.02±0.38）%、（1.19±0.27）%、（1.11±0.48）%、（2.96±0.97）%；與溶劑對照組比較，陽性對照組小鼠精子畸形率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），受試物各劑量組小鼠精子畸型率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。3 討論ames試驗、小鼠精子

15、畸形試驗和小鼠骨髓微核試驗作為遺傳毒性檢測試驗常用經(jīng)典組合。ames試驗檢測終點為基因突變，是由美國生化學(xué)家brucen.ames在1975年建立的鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變試驗，是一種已被公認(rèn)并廣泛開展的致突變鑒定方法。此方法能夠在短期內(nèi)檢測藥物、食品、化學(xué)品、醫(yī)療器械等受試物有無致突變性。小鼠精子畸形試驗檢查受試物能否對破壞哺乳動物精子正常形態(tài)。體內(nèi)微核試驗?zāi)軌驒z測斷裂劑和部分非整倍體誘變劑。有些中草藥具有延緩并消除疲勞、改善激素分泌、提高免疫能力等多種作用，又與運動關(guān)系密切。所以，開發(fā)中草藥運動補劑對提高運動能力、對改善人體功能有重要意義。前期已有研究表明該黎族驗方具有抗疲勞作用的效果，且該方

16、在海南黎族地區(qū)應(yīng)用較多，故進(jìn)行遺傳毒性的相關(guān)考察具有重要意義。研究結(jié)果表明，與溶劑對照組比較，受試物各劑量組小鼠骨髓微核細(xì)胞率和精子畸型率均無明顯變化，提示其對小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞均無誘變作用。ames試驗結(jié)果顯示，受試物各劑量組受試菌株（ta97、ta98、ta100、ta102）在加s9與不加s9時回變菌落數(shù)均未超過未處理對照菌落數(shù)的2倍，提示該受試物無間接和直接的致突變作用。綜上所述，在一定劑量范圍內(nèi)，該黎藥驗方無致突變和致畸作用。感謝五指山黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會及楊麗娜女士提供該黎族驗方。考慮到本研究所用動物種類局限性，還應(yīng)擴(kuò)大實驗動物種屬，增加其他實驗項目進(jìn)一步探討其遺傳毒性，以確保人

17、體服用的安全性。參考文獻(xiàn)1張燕，張洪斌.復(fù)體力湯對運動小鼠抗疲勞的實驗研究 j.華西藥學(xué)雜志，2010，25（5）：557-558.2時群，韋大器，陳麗文，等. 牛大力莖段組織培養(yǎng)污染率控制方法的初步研究j.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，10（3）：63 -65.3黎瑞汝，陳占科，高 珊，等. 中藥牛大力的研究進(jìn)展 j.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（12）：164-166.4國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）s. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.5符影，程悅，陳建萍，等. 雞血藤化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展j.中草藥，2011，42（6）：1229-1233.6張浩，申玉清.雞血藤醇提物對血虛模型小鼠的補血作用 j.中國藥房，2014，25（3）：221-223.7g