SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳簡單原理和步驟實用教案

1、一、概述(i sh) 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是蛋白質(zhì)分析過程中最常用的技術(shù)，通常在電泳分離時，其遷移率主要取決于蛋白質(zhì)本身所帶的電荷多少、分子量大小和形態(tài)。但如在PAGE中加入陰離子去污劑SDS, SDS將蛋白質(zhì)的二硫鍵、氫鍵及梳水鍵打開，使蛋白質(zhì)變性， SDS將包裹在變性蛋白表面，使蛋白質(zhì)成為剛性分子；同時，由于(yuy)SDS帶有大量負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)本身帶有的電荷可忽略。至此情況下，不同蛋白質(zhì)分子的遷移率主要決定于帶有的SDS量，即蛋白質(zhì)分子的大小。因此利用SDS-PAGE可測定蛋白質(zhì)的分子量。第1頁/共8頁第一頁，共9頁。二、試劑(shj)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體溶液

2、(Acr和Bis) 稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺，加水至100ml，過濾后存于棕色瓶中，于4保存。4X分離膠緩沖液 稱取Tris 1817g，加入10%SDS貯備(zhbi)液4ml，用12mol/L HCl調(diào)pH至8，8，定容至100ml。4X濃縮膠緩沖液 稱取，加入10%SDS 4ml，用l2mol/L HCI調(diào)pH至68，定容至100ml。10%過硫酸銨 稱取過硫酸銨，加水至5ml。本儲存液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。10X電極緩沖液 稱取Tris 30g、甘氨酸144g，加入10%SDSl00ml，定容至1000ml。2X樣品緩沖液 稱取蔗糖2g(或甘油2m1)，加入10% SDS 2ml，溴酚

3、藍(lán)，濃縮膠緩沖液、-巰基乙醇，加水定容至10ml。染色液 稱取考馬斯亮藍(lán)，加入甲醇450ml，冰乙酸l00ml、水650ml。 脫色液 甲醇100ml，冰乙酸100ml，加水800m1.第2頁/共8頁第二頁，共9頁。三、操作步驟1、分離膠的制備(1). 根據(jù)所分離的蛋白質(zhì)分子量選擇分離膠的濃度，制備不同濃度的凝膠所需的儲備液可參考下表，該配方可配制厚、10cm X 7cm的凝膠。在配制凝膠時，將水、30Acr和Bis儲液、4X分離膠儲液混合完全后，真空脫氣5分鐘，然后加入過硫酸胺和TEMED，立即準(zhǔn)備灌制凝膠。 (2). 將混合液充分混合后，緩慢地倒入已經(jīng)固定在夾心垂直平板電泳槽里的狹槽中，注

4、意在本操作過程中不能產(chǎn)生任何氣泡(qpo)。然后盡快地在分離膠的上面輕輕地覆蓋一層水。(3). 置于室溫下15-30分鐘，使凝膠聚合完全 (在水相和凝膠的交界處有一明顯的亮線)。除去上層水相，然后再用水或濃縮膠緩沖液，pH6.8, 0.1%SDS) 洗凝膠表面，準(zhǔn)備灌制濃縮膠。第3頁/共8頁第三頁，共9頁。不同濃度(nngd)凝膠的制備 成 份不同濃度所需的儲備液體積 8.5%10%12.51517.5%H2030% Acr和Bis分離膠4X緩沖液10% 過硫酸銨TEMED3.5ml2.0mll.9ml112 u15 ul3.1ml2.4ml1.9ml112 ul5 ul2.5ml3.Oml1

5、.9ml112 ul5 ul1.8ml3.7ml1.9ml112 ul5 ul1.2ml4.3ml1.9ml112ul5ul 第4頁/共8頁第四頁，共9頁。2. 濃縮(nn su)膠制備的方法(1). 將丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體儲備液，濃縮膠緩沖液888u1、水2ml、10過硫酸銨56ul、TEMEDl0ul混合均勻后，立即灌膠。(2). 將預(yù)先制備好的濃縮膠慢慢地灌進狹槽中， 然后將所需的樣品(yngpn)梳(形成加樣孔)插于夾心槽上部，并上下輕輕拉動梳子，小心地去除粘附在梳齒頂部的小氣泡，待聚合完全后即可拔去梳子，準(zhǔn)備電泳。第5頁/共8頁第五頁，共9頁。3. 樣品(yngpn)制備及電

6、泳(1). 樣品處理：蛋白質(zhì)樣品和分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在上樣電泳前均需變性。通常是將樣品蛋白質(zhì)溶液與等體積的樣品緩沖液混合后置于eppendorf管中，將混合物置于95-100加熱5分鐘，立即置于冰上，或于-20儲存，以便再次分析時使用。(2). 上樣：樣品制備好以后，即可上樣電泳。先將樣品梳子(sh zi)移去，用雙蒸水淋洗每個樣品孔，然后在樣品孔中加入電泳緩沖液，同時在電泳槽中也加滿電泳緩沖液。處理完畢后，根據(jù)實驗的需要加樣電泳。(3). 電泳：通常使用穩(wěn)流的方式進行電泳，電流一般為18mA，時間大約3-4小時。第6頁/共8頁第六頁，共9頁。4、凝膠的染色(rns)與脫色電泳完畢后，倒去電泳緩沖液，取出夾心槽。小心地取出凝膠，置于染色液中染色4小時，并不時地輕輕晃動。染色完畢后，倒去染色液，用少量(sholing)水淋洗凝膠，然后置于脫色液中脫色，并輕輕晃動，脫色至藍(lán)色背景消失為止。此凝膠即可用于分析。考馬斯亮藍(lán)檢測靈敏度為0.3-1 ug/蛋白帶。銀染檢測靈敏度為0.1-1.0 ng/蛋白帶,比考馬斯亮藍(lán)檢測靈敏度高100-1000倍。第7頁/共8頁第七頁，共9頁。感謝您的觀看(gunkn)！第8頁/共8頁第八頁，共9頁。NoImage內(nèi)容(nirng)總結(jié)一、概述(i sh)。同時，由于SDS帶有大量負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)本身帶有的電荷可忽略。10%過硫酸銨 稱取過硫酸銨，加水至