基于rnaseq技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本tsnaxdisc1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究

1、 SOOCHOW UNIVERSITY 碩 士 學(xué) 位 論 文 論文題目 基于 RNA-Seq 技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 研 究 生 姓 名 李 娜 指 導(dǎo) 教 師姓 名 周翊峰 專業(yè)名稱 遺傳學(xué) 研究方向 腫瘤病因?qū)W 論 文 提 交日 期 2014 年 4 月 II 基于基于 RNA-Seq 技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 中文摘要中文摘要 中文摘要 作為一種特殊的個(gè)體突變，融合基因是由兩個(gè)相鄰基因的全部或一部分序列相互融合，通

2、過基因間剪接從而形成的一種新的轉(zhuǎn)錄物。越來越多的研究表明，融合基因與多種腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)，但是與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性研究還尚未報(bào)道。 本研究采用 Ilumina HiSequence2000 測(cè)序平臺(tái)對(duì) 9 對(duì)子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織進(jìn)行 100bp 雙末端轉(zhuǎn)錄本測(cè)序檢測(cè)差異表達(dá)的融合基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于子宮內(nèi)膜癌易感區(qū)域1q42.2內(nèi)的融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1在子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織中存在顯著的表達(dá)差異，該融合轉(zhuǎn)錄本在多數(shù)癌組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)。利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）的方法，我們發(fā)現(xiàn)融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1

3、并非通過染色體重排的方式形成， 而是由相鄰基因TSNAX 和DISC1 的基因間剪接導(dǎo)致的。進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析顯示，CCCTC-結(jié)合因子（CTCF）在 TSNAX 和 DISC1 基因間的絕緣子元件上的結(jié)合強(qiáng)度與該融合轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。位于 TSNAX 和 DISC1 基因間的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA lincRNA-NR_034037，通過干擾絕緣子與 CTCF 的相互作用調(diào)控融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1 的形成以及 TSNAX/DISC1 的表達(dá)水平。另外，熒光素酶報(bào)告基因以及染色質(zhì)免疫共沉淀 （ChIP） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 異常表達(dá)的 TSNAX 可顯著抑制 TRAX、Translin

4、 和 SF-1 三者形成的蛋白復(fù)合體在類固醇激素合成急性調(diào)控蛋白（StAR）基因啟動(dòng)子上的募集，調(diào)節(jié) StAR 基因的轉(zhuǎn)錄活性。這些研究結(jié)果表明，lincRNA-NR_034037 可能通過調(diào)控融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 的形成，參與子宮內(nèi)膜癌的病理過程。 關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：融合轉(zhuǎn)錄本，基因間長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，基因間剪接，高通量轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，子宮內(nèi)膜癌 作作 者：李者：李 娜娜 指導(dǎo)老師：周翊峰指導(dǎo)老師：周翊峰 英文摘要英文摘要 基于基于RNA-Seq技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 I

5、I Identification of chimeric transcript TSNAX-DISC1 in endometrial carcinoma through RNA-Seq Abstract As a prevalent class of mutations, fusion genes are resulting from intergenic splicing between two adjacent genes conjoined into a single gene and can generate new transcripts. Several fusion genes

6、have been nominated as a potent pathway of oncogenesis in many human cancers. However, whether fusion gene is implicated in endometrial carcinoma (EC) or not is unknown. Here, by paired-end transcriptome sequencing (RNA-Seq) in 9 paired human endometrial carcinoma and matched non-cancerous tissues,

7、we show that chimeric transcript TSNAX-DISC1 located on chromosome 1q42.2, an EC risk-related susceptibility locus, occurred in significantly higher level in multiple EC samples than in matched non-cancerous tissues. Based on reverse transcription PCR analysis, TSNAX-DISC1 appears to be formed by in

8、tergenic splicing of adjacent genes without chromosomal rearrangement. The binding of CCCTC-binding factor (CTCF) to the insulator elements is inversely correlated with the expression of the chimera. Subsequent investigations indicate that the long intergenic noncoding RNA lincRNA-NR_034037, separat

9、ing TSNAX from the downstream DISC1, regulates chimeric TSNAX-DISC1 production and TSNAX/DISC1 expression levels by extricating CTCF from insulator elements. In addition, luciferase reporter and ChIP assays indicated that dysregulation of TSNAX significantly attenuated the binding of TSNAX, Translin

10、 and SF-1 formed a complex to the StAR promoter and modulated StAR gene transcription. Together, these results advance our understanding of the mechanism in which lincRNA-NR_034037 regulates TSNAX-DISC1 formation programs that tightly regulate EC development. Keywords: fusion transcript, long interg

11、enic noncoding RNA, intergenic splicing, RNA-Seq, endometrial carcinoma Written by: Na Li Supervised by: Yifeng Zhou 目 錄 一、前言 . 1 二、材料與方法 . 3 2.1 材料 . 3 2.1.1 研究對(duì)象 . 3 2.1.2 主要試劑與儀器 . 4 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 . 6 2.2.1 RNA 高通量測(cè)序和融合轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè) . 6 2.2.2 融合轉(zhuǎn)錄本的驗(yàn)證 . 7 2.2.3 細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn) . 7 2.2.4 實(shí)時(shí)定量 PCR . 7 2.2.5 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)

12、建 . 9 2.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及熒光素酶活性分析 . 10 2.2.7 Western blot 和免疫熒光檢測(cè) . 10 2.2.8 電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA） . 11 2.2.9 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP） . 12 2.2.10 RNA 免疫沉淀（RIP） . 13 2.2.11 細(xì)胞周期分析 . 13 2.2.12 細(xì)胞增殖檢測(cè) . 14 2.2.13 集落形成實(shí)驗(yàn) . 14 2.2.14 小鼠成瘤模型的構(gòu)建 . 14 2.3 統(tǒng)計(jì)分析 . 14 三、結(jié)果 . 15 3.1RNA-seq 檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織中融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1 的表達(dá).15 3.2融合轉(zhuǎn)錄本

13、TSNAX-DISC1在子宮內(nèi)膜癌中的驗(yàn)證.16 3.3由染色體重排導(dǎo)致的融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1形成機(jī)制的排除.18 3.4 絕緣子與 CTCF 的相互作用影響融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 的形成.19 3.5lincRNA-NR_034037 通過調(diào)控 TSNAX 和 DISC1 基因間絕緣子與 CTCF 的相 互作用促進(jìn)融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 形成.22 3.6TRAX/Translin 異構(gòu)體與 SF-1 協(xié)同激活StAR 基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性.26 3.7lincRNA-NR_034037對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期的影響.29 3.8lincRNA-NR_0340

14、37對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響.30 3.9lincRNA-NR_034037對(duì)裸鼠成瘤的的影響.31 四、討論 . 33 參考文獻(xiàn) . 37 綜述 . 42 攻讀碩士學(xué)位期間公開發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 . 53 附 錄 . 54 感謝信 . 55 基于基于 RNA-Seq 技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 一、一、 1 一、前言 子宮內(nèi)膜癌（Endometrial carcinoma）作為危害女性健康最常見的女性惡性腫瘤之一，約占女性腫瘤的 7%。近年來其發(fā)病率和死亡率逐年上升，并且呈現(xiàn)年輕化的

15、趨勢(shì)1。目前子宮內(nèi)膜癌的確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道顯示，較早或較晚的初潮年齡、肥胖、絕經(jīng)晚、他莫昔芬的使用和荷爾蒙替代治療等都可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)2, 3。然而，通常只有一小部分暴露在上述相同環(huán)境下的個(gè)體罹患子宮內(nèi)膜癌，這也提示遺傳因素可能也是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素4-9。 近年來，基于新一代高通量測(cè)序技術(shù)靈敏度的提高，測(cè)序成本的降低，全面細(xì)致的高通量分析（如可變剪接、基因融合的研究，全新轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)等）等優(yōu)勢(shì)，可以預(yù)見，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)將成為科學(xué)研究者們廣泛用來尋找癌癥和新疾病的有力工具10, 11。作為一種特有的個(gè)體突變，融合基因是由兩個(gè)獨(dú)立的基因融合在

16、一起形成的一種新的轉(zhuǎn)錄物，可作為臨床上理想的診斷標(biāo)記物和合理的治療靶點(diǎn)。目前，由染色體重排而導(dǎo)致的基因融合被認(rèn)為是融合基因形成的主要原因。但是 2012 年，弗吉尼亞大學(xué)的研究者 Zhang et al.等首次提出來了融合轉(zhuǎn)錄本還可以通過一種順式剪接（cis-splicing）的方式形成12, 13。即兩個(gè)相鄰的基因可能先以“讀通”（read-through）的方式轉(zhuǎn)錄出一個(gè) pre-mRNA，然后該 pre-mRNA 通過剪接，形成一個(gè)新的融合轉(zhuǎn)錄本。近年來研究發(fā)現(xiàn)基因融合與罕見的軟組織腫瘤，血液惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)11。最近在一些常見的實(shí)體瘤中也發(fā)現(xiàn)了融合基因的存在，如前列腺癌14和

17、卵巢癌15。 位于亞洲女性子宮內(nèi)膜癌易感區(qū)段 1q42.216內(nèi)的融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1，含有基因 TSNAX（translin-associated factor X）前四個(gè)外顯子和基因 DISC1（disrupted-in-schizophrenia 1） 第一個(gè)外顯子。 文獻(xiàn)報(bào)道 TSNAX 編碼的蛋白 TRAX通過與它的配體 Translin 相互作用共同參與了多種生物過程的調(diào)節(jié)， 包括細(xì)胞生長(zhǎng)17, 18，基因組穩(wěn)定性的調(diào)控19，DNA 損傷修復(fù)20, 21和腫瘤的發(fā)生22-25。另外 Mellon et al.等研究者發(fā)現(xiàn) TRAX 與 Translin 在基礎(chǔ)條件下形

18、成的復(fù)合體能夠增強(qiáng)類固醇生長(zhǎng)因子 SF-1 對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控26。 已有研究報(bào)道證明， SF-1一、一、 基于基于RNA-Seq技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 2 可以通過與類固醇激素合成急性調(diào)控蛋白（StAR）啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄27， StAR 基因極有可能參與了子宮內(nèi)膜中雌激素的代謝和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)， 而激素水平的變化也是影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的一個(gè)重要因素。目前，對(duì)于 DISC1 基因的研究主要集中在精神分裂癥和情緒障礙等領(lǐng)域，該基因在維護(hù)心理健康和神經(jīng)元的發(fā)育方面起著至關(guān)

19、重要的作用28, 29。另外，DISC1 基因的異常表達(dá)有可能引起新生神經(jīng)元遷移和錯(cuò)誤定位，并最終導(dǎo)致海馬細(xì)胞發(fā)育異常。近來也有一些報(bào)道發(fā)現(xiàn)該基因與腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)聯(lián)30, 31。關(guān)于融合基因TSNAX-DISC1 的形成機(jī)制，最初的研究表明，該融合基因可能是通過相鄰基因TSNAX 和 DISC1 的基因間剪接形成32。然而，調(diào)控 TSNAX-DISC1 形成的確切機(jī)制，以及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未得到深入研究。 通過對(duì)融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 所在基因區(qū)域進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼 RNA lincRNA-NR_034037 位于 TSNAX 和 DISC1 兩基因間。同時(shí)

20、，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在兩基因間區(qū)域內(nèi)存在多個(gè)含有 CTCF 結(jié)合序列的絕緣子元件。作為一種多功能的轉(zhuǎn)錄因子， CTCF 與處于染色體結(jié)構(gòu)域上的邊界元件絕緣子的活性密切相關(guān)33, 34?？紤]到 lincRNA-NR_034037 特殊的位置，以及基因間區(qū)域富集的大量的 CTCF 結(jié)合位點(diǎn)，我們推測(cè)，lincRNA-NR_034037 可能通過調(diào)節(jié)相鄰基因TSNAX 和 DISC1 基因間的絕緣子元件與 CTCF 的相互作用影響融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1 的形成。 基于以上假設(shè)， 我們通過 Ilumina HiSequence2000 測(cè)序平臺(tái)對(duì) 9 對(duì)子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織進(jìn)行 100bp

21、雙末端轉(zhuǎn)錄本測(cè)序分析，檢測(cè)到差異表達(dá)的融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1。并且采用實(shí)時(shí)定量 PCR 的方法在另外的 176 對(duì)子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織中對(duì)該融合轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)做了進(jìn)一步驗(yàn)證。為了研究 TSNAX-DISC1 形成的機(jī)制，我們采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)排除染色體重排的可能，接下來通過檢測(cè) lincRNA-NR_034037 的表達(dá)水平，基因間絕緣子元件與 CTCF 的結(jié)合強(qiáng)度以及融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 的表達(dá)水平三者的相關(guān)性來研究 TSNAX-DISC1形成的機(jī)制。 基于基于 RNA-Seq 技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-D

22、ISC1 與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 二、二、 3 二、材料與方法 2.1 材料 2.1.1 研究對(duì)象 176 對(duì)子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織分別來自中國東部和南部無直接親屬關(guān)系的中國漢族人群。從東部人群中收集的 104 對(duì)子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織來自蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 2003 年 3 月至 2009 年 5 月手術(shù)切除。這些子宮內(nèi)膜癌患者來自蘇州及周邊地區(qū)。從南部人群中收集的 72 對(duì)子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織來源于廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 2002 年 3 月至 2009 年 6 月手術(shù)切除。病人來自廣州市以及周邊地區(qū)。本研究所收集的組織標(biāo)本均經(jīng)過了病理學(xué)確診，所有研究病

23、例在手術(shù)之前沒有經(jīng)過任何的抗腫瘤藥物治療，放療和化療。在組織樣本收集時(shí)，所有研究對(duì)象都簽署了知情同意書，以病例和問卷等方式收集并記錄所有個(gè)體的基本特征、臨床病理分期、 腫瘤家族史等信息， 每個(gè)腫瘤病人的具體臨床特征歸納于 Table 1 中。同時(shí)本研究得到了蘇州大學(xué)和廣州醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。 用于 RNA-seq 測(cè)序的研究對(duì)象：9 對(duì)新鮮的子宮內(nèi)膜癌及其癌旁組織是從蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集的。所有患者術(shù)前均由病理學(xué)證實(shí)為子宮內(nèi)膜癌，未接受針對(duì)腫瘤的任何治療。 細(xì)胞系： 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系(HEC-1-A 和 HEC-1-B)購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。使用含有 10%胎牛

24、血清的 MEM 培養(yǎng)基,培養(yǎng)于 5%CO2、37oC恒溫培養(yǎng)箱中。 裸鼠：雌性 BALB/C（nu/nu）裸鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，鼠齡 4-6周，體重質(zhì)量 20-25g，所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全按照蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的指導(dǎo)方針進(jìn)行。 二、二、 基于基于RNA-Seq技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 4 Table 1. Clinicopathological characteristics of endometrial cancer patients in Chinese popula

25、tion Characteristics Suzhou population Guangzhou population Overall N (%) N (%) N (%) Age (years) 65 53 (51.0) 33 (45.8) 86 (48.9) 65 51 (49.0) 39 (54.2) 90 (51.1) Age at menarche (years) 11 7 (6.7) 2 (2.8) 9 (5.1) 11-16 67 (64.4) 52 (72.2) 119 (67.6) 16 30 (28.8) 18 (25.0) 48 (27.3) Menopausal stat

26、us Premenopausal 32 (30.8) 16 (22.2) 48 (27.3) Postmenopausal 72 (69.2) 56 (77.8) 128 (72.7) Family history of cancer Positive 8 (7.7) 5 (6.9) 13 (7.4) Negative 96 (92.3) 67 (93.1) 163 (92.6) BMI 25 41 (39.4) 25 (34.7) 66 (37.5) 25 63 (60.6) 47 (65.3) 110 (62.5) FIGO stage I 79 (76.0) 58 (80.6) 137

27、(77.8) II 7 (6.7) 6 (8.3) 13 (7.4) III 18 (17.3) 8 (11.1) 26 (14.8) Histologic type Endometrioid 91 (87.5) 66 (91.7) 157 (89.2) Non-endometrioid 13 (12.5) 6 (8.3) 19 (10.8) Grade G1 44 (42.3) 27 (37.5) 71 (40.3) G2 53 (51.0) 41 (57.0) 94 (53.4) G3 7 (6.7) 4 (5.5) 11 (6.3) 2.1.2 主要試劑與儀器 名稱 生產(chǎn)商 試劑 細(xì)胞組

28、織基因組 DNA 提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司 QiaQiuck PCR 試劑盒 德國 QIAGEN 公司 柱式質(zhì)粒 DNA 抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司 Taq DNA Polymerase 美國 Fermentas 公司 基于基于 RNA-Seq 技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 二、二、 5 Lipofectamin 2000 美國 Invtrogen 公司 dNTP 美國 Promega 公司 DNA Marker 美國 Fermentas 公司 Xho

29、I, NotI 內(nèi)切酶 TakaRa 公司（大連） 基因引物 蘇州金唯智生物科技有限公司 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 美國 Promega 公司 Trizol 試劑盒 寶生物工程有限公司（大連） 胎牛血清 美國 HyClone 公司 Mouse Anti-TRAX antibody 美國 Santa Cruz 公司 Mouse Anti-DISC1 antibody 美國 Santa Cruz 公司 Mouse Anti-StAR antibody 美國 Santa Cruz 公司 Mouse Anti-CTCF antibody 美國 Cell Signaling 公司 山羊抗鼠 IgG 美

30、國 Abcam 公司 Mouse Anti-SF-1 antibody 美國 Abcam 公司 M-MLV Reverse transcriptase 美國 Fermentas 公司 T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒 上?？泼羯锟萍加邢薰?化學(xué)發(fā)光 DNA/RNA EMSA 試劑盒 美國 Pierce 公司 DNA/RNA 探針 美國 Invitrogen 公司 免疫熒光染色試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所 細(xì)胞核/胞漿細(xì)胞組分提取試劑盒 美國 Biovision 公司 EZ CHIP KIT/Chip 試劑盒 美國 Millipore 公司 儀器 超凈工作臺(tái) 深圳市百鑫凈化科技有限公司 生化培養(yǎng)箱 上海

31、博訊實(shí)業(yè)有限公司 低溫高速離心機(jī) 德國 Hettich 公司 漩渦混合器 太倉科教器械廠 紫外分光光度計(jì) 日本 Shimadzu 公司 基因擴(kuò)增儀 德國 Eppendorf 公司 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、垂直電泳槽 北京六一儀器廠 全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng) 美國 UVP 公司 醫(yī)用 X 射線洗片機(jī) Kodak 公司 恒溫水浴鍋 北京醫(yī)療器械公司 雪花制冰機(jī) 廈門國儀科學(xué)儀器有限公司 二、二、 基于基于RNA-Seq技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 6 手提式壓力蒸汽滅菌器 北京鑫潤(rùn)科諾儀器儀表有限公司 超低

32、溫冰箱 美國 Thermo 公司 熒光定量 PCR 儀 Applied Biosystems 公司 基因擴(kuò)增儀 德國 Eppendorf 公司 電子天平 上海方瑞儀器有限公司 多功能酶標(biāo)儀 美國 Thermo 公司 倒置顯微鏡 日本 Olympus 光學(xué)有限公司 37oC恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 重慶實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 RNA 高通量測(cè)序和融合轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè) 樣本的制備 按照生產(chǎn)廠家提供的步驟采用 TRIzol 試劑從 9 對(duì)子宮內(nèi)膜癌和癌旁組織中提取總 RNA。RNA 樣品在使用之前都預(yù)先使用 DNase 處理和去除蛋白質(zhì)，保證樣品總量均大于 10g，濃度均大于

33、 10g/l；純度要求 OD260/280保持在 1.8-2.2 之間，RIN 大于 7.5，28S/18S 大于 1.0，-80oC 保存。 文庫制備、高通量測(cè)序 對(duì)提取獲得的 RNA 樣品，用帶有 Oligo（dT）的磁珠富集處理。然后將富集所得 RNA 打斷成短片段， 并以其為模板， 用六堿基隨機(jī)引物合成第一條 cDNA 鏈，隨后再加入 dNTP、RNase H 和 DNA polymerase I 合成第二條鏈；在經(jīng)過 QiaQiuck PCR 試劑盒（德國 QIAGEN 公司）純化和末端修復(fù)后，加 poly（A）并連接測(cè)序接頭； 瓊脂糖凝膠電泳篩選目的片段并 PCR

34、擴(kuò)增， 建好文庫 （200bp） 后使用 Illumina HiSeq2000 進(jìn)行 100bp 雙向測(cè)序（即 pair-end 測(cè)序）得到足夠的序列。 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 通過 hg19 human reference genome (NCBI build 37), UCSC known Gene (February 2009, hg19) and Ensembl release 62 annotation 數(shù)據(jù)庫， 將測(cè)序得到的 reads比對(duì)到參考基因組或參考序列上，再通過 Tophat，F(xiàn)usionSeq 軟件進(jìn)行候選融合基因的檢測(cè)。最后使用 FPKM 法（Fragments

35、 Per kb per Million reads）計(jì)算基因的表達(dá)量； 本研究主要使用了 Cufflinks 2、 Tophat 2 和 CPAT （Coding-Protein Assessment Tool）三種軟件。 基于基于 RNA-Seq 技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 二、二、 7 2.2.2 融合轉(zhuǎn)錄本的驗(yàn)證 按照Invitrogen公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的實(shí)驗(yàn)步驟從子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞中提取總的 RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。具體操作步驟如下：首先取 2g 總 RNA （

36、800ng） ，加 1l oligoDT，加入 DEPC 水使總體積為 10l，輕彈離心管底部至混勻，然后將將離心管放置 70oC 水浴鍋中加熱 10 分鐘后立即置于冰上冷卻 35 分鐘。往管底加入 2l 10 合成緩沖液，2l 0.1M DTT 輕輕混均勻后，42oC 水浴 2 分鐘， 加入 1l 10mM dNTP， 50U 逆轉(zhuǎn)錄酶， 42oC 水浴 50 分鐘后 70oC 加熱 15 分鐘，用以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。然后加入 2U RNaseH，37oC 保溫 20 分鐘去除多余的 RNA，產(chǎn)物放置于-80oC 保存。然后通過 2%瓊脂糖凝膠電泳和 Sanger 測(cè)序的方法來檢測(cè)融合轉(zhuǎn)錄本的存

37、在。 2.2.3 細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn) 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株 HEC-1-A 和 HEC-1-B 使用含有 10%胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基,放置于 5%CO2、 37oC 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天至細(xì)胞多達(dá) 2 106個(gè)。 細(xì)胞核/胞漿組分的提取完全參照美國Biovision公司生產(chǎn)的細(xì)胞核/胞漿細(xì)胞組分提取試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟操作。600g 4oC 離心 5 分鐘收集細(xì)胞，加入含有 DTT 和蛋白酶抑制劑的 0.2ml 細(xì)胞質(zhì)提取混合緩沖液 A，渦旋震蕩 15 秒，冰上放置 10 分鐘，往管中加入 11l 預(yù)冷的細(xì)胞質(zhì)提取緩沖液 B 后渦旋震蕩 5 秒，冰上孵育 1 分鐘，渦旋震蕩 5 秒后，以最大轉(zhuǎn)

38、速 16000g 離心 5min，立即轉(zhuǎn)移上清液（細(xì)胞質(zhì)提取液）到一個(gè)干凈的預(yù)冷試管中，放置到冰上。接下來，加入 100l 預(yù)冷的核抽提混合緩沖液重旋含有細(xì)胞核的細(xì)胞沉淀，渦旋震蕩 15 秒，重新放回至冰上，每十分鐘重復(fù)此步驟一遍， 共重復(fù) 4 次， 以最大轉(zhuǎn)速 16000g 離心 5 分鐘， 立即轉(zhuǎn)移上清液 （核提取物）到一個(gè)干凈的離心管中，置于-80oC 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?2.2.4 實(shí)時(shí)定量 PCR 取上述逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 為模板，我們通過 7500 型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀器（Applied Biosystems 公司）來檢測(cè)融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1，

39、lincRNA-NR_034037，StAR，CTCF 和 GAPDH在腫瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)量，基因的表達(dá)量以 GAPDH 的表達(dá)作為參照。TSNAX-DISC1，lincRNA-NR_034037， StAR， CTCF 和 GAPDH 的引物在蘇州金唯智公司合成， 引物序列見于 Table 2。 PCR反應(yīng)為 50L體系包括 2x QuantiTect SYBR Green PCR 25L，正反向引物各 5L以二、二、 基于基于RNA-Seq技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 8 及 10

40、0ng模板 cDNA， 最后加無菌水使總體積為 50L。 反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變形 95oC 15 分鐘，然后 40 個(gè)循環(huán)的變性 95oC 15秒，退火 55oC 30秒，延伸 72oC 30 秒。每個(gè)實(shí)驗(yàn)要獨(dú)立重復(fù)三次，排除誤差確保實(shí)驗(yàn)的精確性。 Table 2. Oligonucleotides used in PCRs and EMSA PCR TSNAX-DISC1 cDNA Forward Reverse 5-GGATCAAGGCTGACAGAAGC-3 5-AATGCCTTCCCAACCTCTCT-3 lincRNA-NR_034037 cDNA Forward Reverse 5-

41、CGGAAAGAACTACGTGAATGTGTA-3 5-GTAAGAAATTCTGGAATGGGAAGA-3 StAR cDNA Forward 5-GCTCTAGAGCTATGCAGAAGGCCTTGGGC-3 Reverse 5-CGGGATCCGCGCTTGCGCAGGTGGTTGGC-3 CTCF cDNA Forward 5-ACCAGTGGAGAATTGGTTCG-3 Reverse 5-TCATGTGCCTTTTCAGCTTG-3 GAPDH cDNA Forward 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 Reverse 5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-

42、3 StAR promoter Forward 5-ACCGCAGGAGGAACTGTGTA-3 Reverse 5-CAGGGTGTTTACCAGGCAGT-3 INSUL_ZHAO01975 Forward 5-AAGTTACCCTCCACCCCATC-3 Reverse 5-AGATCTGCTTTCTCCCACCA-3 INSUL_REN01352 Forward 5-TCCACTAGGGCAGAAGCTGT-3 Reverse 5-GGGCAGGACAAGATGAAGAA-3 INSUL_ZHAO01976 Forward 5-CTCGAGGAGGAGATGTTGGA-3 Revers

43、e 5-AGGGGAAAAGAGCCTCTCAG-3 DNA EMSA INSUL_ZHAO01975 Sense 5Biotin-GCTTCTGCCCTCTAGCGCCC-3 Antisense 5-GGGCGCTAGAGGGCAGAAGC-3 INSUL_REN01352 Sense 5 Biotin-TCCTGCCCTCTGGAAGGTGA-3 Antisense 5-TCACCTTCCAGAGGGCAGGA-3 INSUL_ZHAO01976 Sense 5 Biotin-TTCTACCACCTAGTGGCCAT-3 Antisense 5-ATGGCCACTAGGTGGTAGAA-3

44、 RNA EMSA lincRNA-NR_034037 (probe 1) 5 Biotin-AGUCCAGUCCGUGGUGCUCA-3 5 unlabeled-AGUCCAGUCCGUGGUGCUCA-3 lincRNA-NR_034037 (probe 2) 5 Biotin-AGAACGUCAAGGGGCAGCGU-3 5 unlabeled-AGAACGUCAAGGGGCAGCGU-3 lincRNA-NR_034037 (probe 3) 5 Biotin-CGUUCAGAGGAGGGGAAAGA-3 5 unlabeled-CGUUCAGAGGAGGGGAAAGA-3 siRNA

45、 Translin siRNA 5-UACAACUUUUCUGAUUUCCUC-3 SF-1 siRNA 5-UCUUGUUCUCGAGUAAGUCCA-3 CTCF siRNA 5-UUACUCUUCUUCGUUUCUCCU-3 shRNA lincRNA-NR_034037 shRNA 5-GTTAAGGTAAGAAATTCTGGAATTCAAG AGATTCCAGAATTTCTTACCTTAATTTTTT-3 基于基于 RNA-Seq 技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 二、二、 9

46、2.2.5 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建 以 lincRNA-NR_034037 mRNA 為模板，設(shè)計(jì)分別含有 XhoI，NotI 酶切位點(diǎn)的正 反 向引 物， 由蘇州 金 唯智 生物 科技有 限 公司 合成 ，利用 PCR 合 成lincRNA-NR_034037 mRNA。另外我們從上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司購買針對(duì)lincRNA-NR_034037 的短發(fā)夾 RNA（shRNA） 。用限制性內(nèi)切酶 XhoI, NotI 分別對(duì)PCR 產(chǎn)物和慢病毒表達(dá)載體 pLVX-IRES-NEO （美國 Clontech 實(shí)驗(yàn)室） 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切， 采用 DNA 片段純化試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物分離純化后加入 T4

47、連接酶及緩沖液，pLVX-IRES-NEO 質(zhì)粒和 PCR 產(chǎn)物（按照 pLVX 質(zhì)粒：PCR 產(chǎn)物=1:5 比例） ，16oC水浴過夜。利用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5a 對(duì)帶有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增。先通過 PCR 的方法對(duì)陽性克隆進(jìn)行鑒定，然后用含有氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液擴(kuò)增轉(zhuǎn)化菌，利用上海生工公司的質(zhì)粒 DNA 抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒 pLVX-IRES-NEO-lincRNA-NR_034037 和 pLVX-IRES-NEO-lincRNA-NR_03 4037-shRNA 進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000將 3個(gè) 病毒包裝質(zhì)粒

48、瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系 293T。在轉(zhuǎn)染之前將 293T 細(xì)胞接種在 6cm 培養(yǎng)皿上，每孔含有 1 106個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞在含有 10%胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)達(dá)到 70%80%融合，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。病毒包裝具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將 12.5g包裝混合質(zhì)粒和 10g的重組質(zhì)粒稀釋于 250l 無血清無雙抗的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育 5分鐘。同樣將 9l 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑稀釋于 250l 無血清無雙抗的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育 5 分鐘。然后將混勻的質(zhì)粒溶液和脂質(zhì)體溶液輕輕混合均勻，室溫孵育 20 分鐘。將 6cm 的培養(yǎng)皿中待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的

49、培養(yǎng)基置換為無血清無雙抗 RPMI1640 培養(yǎng)基，加入質(zhì)粒-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染混合物，前后輕輕搖勻，放置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，68 小時(shí)后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染 4872 小時(shí)后，收集含慢病毒的細(xì)胞上清。2000g 離心 20分鐘，去除細(xì)胞沉淀，用孔徑 0.45m 的細(xì)胞過濾器過濾掉細(xì)胞碎片獲得高濃度的病毒濃縮液，-80 C 貯存?zhèn)溆谩?將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（HEC-1-A 和 HEC-1-B）接種于 6 孔板中，待細(xì)胞融合度在 7080%后，用不同滴度的 lincRNA-NR_034037 慢病毒（載體上含有l(wèi)incRNA-NR_034037 片 段 ， 實(shí) 驗(yàn) 組 ） ， 空 病 毒 （ 空

50、載 體 ， 對(duì) 照 組 ） ， 和lincRNA-NR_034037-shRNA 慢病毒（載體上含有 lincRNA-NR_034037-shRNA，實(shí)驗(yàn)二、二、 基于基于RNA-Seq技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 10 組）分別感染細(xì)胞，24 小時(shí)后每孔更換成新鮮的含有 500g/ml G418（法國 Gibco公司）的篩選培養(yǎng)基。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每 23 天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞不再死亡，換成不含 G418 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到 60%，再用含有 500g/ml

51、 G418 的篩選培養(yǎng)基篩選，大約感染后 1215 天，以后每隔 45天再用含有 500g/ml G418 的篩選培養(yǎng)基篩選一次直至篩選出耐藥的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞群，用于隨后的研究。 2.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及熒光素酶活性分析 有文獻(xiàn)報(bào)道 TRAX 與 Translin 形成的異構(gòu)體可以增強(qiáng) SF-1 對(duì) StAR 基因的轉(zhuǎn)錄活性。此外，StAR 基因極有可能參與了子宮內(nèi)膜中的雌激素代謝與轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，而激素水平的變化也是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的一個(gè)重要因素。我們根據(jù)已知文章報(bào)道的 SF-1 在 StAR 基因啟動(dòng)子序列上的結(jié)合位點(diǎn)26，在-835bp 至+1bp 啟動(dòng)子區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，在上下引物中分別加入限制性

52、內(nèi)切酶 SacI和 BglII的酶切位點(diǎn)，并添加相應(yīng)的保護(hù)堿基。 擴(kuò)增的片段經(jīng) SacI和BglII雙酶切純化后連接到 PGL-3 Basic質(zhì)粒的 SacI/BglII 多克隆位點(diǎn)間。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒 PGL-3-StAR 經(jīng)過雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確完整性。 lincRNA-NR_034037 高表達(dá)和低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（HEC-1-A-lincRNA-NR_034037，HEC-1-A-lincRNA-NR_034037-shRNA，HEC-1-B-control，HEC-1-B-lincRNA-NR_034037，和 HEC-1-B-lincRNA-NR_0340 37-

53、shRNA）接種于 24 孔板中，細(xì)胞使用含有 10%胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基,在5%CO2、37oC 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到 60-70%融合，參照廠商的使用說明利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司將2.25g重組質(zhì)粒PGL-3-StAR與 20pmol Translin-siRNA 或者 SF-siRNA（上海吉瑪公司）共轉(zhuǎn)染 lincRNA-NR_03 4037 高表達(dá)和lincRNA-NR_034037低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。 轉(zhuǎn)染1624h后，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒操作說明，先用裂解液裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到離心

54、管中，12000g離心 2 分鐘后，轉(zhuǎn)移 20l 上清到新的離心管中，加入 100l 熒光素酶檢測(cè)試劑，混合均勻后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3 次，每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔以減少誤差。 2.2.7 Western blot 和免疫熒光檢測(cè) 首先從子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞（HEC-1-A 和 HEC-1-B）和子宮內(nèi)膜癌組織中獲得總基于基于 RNA-Seq 技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本 TSNAX-DISC1 與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 二、二、 11 蛋白。將準(zhǔn)備好的樣品 30l（15l 總蛋白，4l 上樣緩沖液和

55、 1l DTT 混勻，100oC沸水中水浴 510 分鐘）加入配好的 SDS-PAGE 膠的點(diǎn)樣孔中，先恒壓（60V）30分鐘，再 120V 恒壓電泳，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適時(shí)結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜槽中轉(zhuǎn)模（恒流 250mA） ，23 小時(shí)后，然后根據(jù)目的蛋白加入用封閉液稀釋的相對(duì)應(yīng)抗體（DISC1，1：5000； TRAX，1：500 和 StAR，1：500，美國 Santa Cruz 公司； CTCF， 1： 1000， 美國 Cell Signaling 公司； SF-1， 1： 1000， 美國 Abcam公司） ，4oC 過夜。用 TBST 清洗一抗后，室溫下孵育二抗 2 小

56、時(shí)，同樣用 TBST洗去二抗，在 ECL 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)物中反應(yīng) 2 分鐘后，在暗室中壓 X 光片，顯影定影。利用光用密度掃描儀對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選取 -actin 作為內(nèi)參。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù) 3 次。 參照免疫熒光染色試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）中的實(shí)驗(yàn)操作說明檢測(cè) DISC1 和 TRAX 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株內(nèi)的定位和表達(dá)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下，首先在 6 孔板內(nèi)制作子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞爬片，然后用 PBS 清洗細(xì)胞爬片，使用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭?xì)胞后，在搖床上利用免疫染色洗滌液洗滌兩次，每次 5 分鐘，加入免疫染色封閉液，封閉 60 分鐘。接著按適當(dāng)比例用免疫染色一抗稀釋液稀釋小鼠抗人 DISC

57、1 和 TRAX 的單克隆抗體 （DISC1， 1： 50 稀釋和 TRAX， 1： 20 稀釋） ，4oC 過夜。參照二抗說明書，按適當(dāng)比例用免疫染色二抗稀釋液稀釋熒光標(biāo)記的二抗 Cy5（1：1000） ，室溫下孵育 1 小時(shí)，隨后使用 DAPI 對(duì)細(xì)胞核染色，5 分鐘后，立即采用試劑盒中的封片劑封片。在激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2，德國）下觀擦 DISC1 和 TRAX 在細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果。 2.2.8 電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA） 通過生物信息學(xué)的方法， 我們發(fā)現(xiàn)在 TSNAX 和 DISC1 基因之間存在著 三 個(gè)絕緣子：絕緣子 1（INSUL_ZHAO01975）,

58、絕緣子 2（INSUL_REN01352）,絕緣子3（INSUL_ZHAO01976），并且使用 CTCF 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（http:/insulatordb.utm ），在絕緣子（1，2，3）和 lincRNA-NR_0340373 轉(zhuǎn)錄本上分別預(yù)測(cè)到 3個(gè) CTCF 結(jié)合位點(diǎn)。 接下來我們參照 LightShift 化學(xué)發(fā)光 EMSA 試劑盒 （美國 Pierce公司）中的實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)絕緣子和 lincRNA-NR_0340373 與 CTCF 蛋白因子的結(jié)合情況，同時(shí)采用競(jìng)爭(zhēng)性 EMSA 的方法來確定 lincRNA-NR_034037 與絕緣子內(nèi)的CTCF 結(jié)合位點(diǎn)是否存在

59、競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。對(duì)于 DNA-EMSA，實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)要如下：首先二、二、 基于基于RNA-Seq技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本技術(shù)篩選的功能性融合轉(zhuǎn)錄本TSNAX-DISC1與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究 12 合成 5端生物素標(biāo)記和非標(biāo)記含有 CTCF 結(jié)合位點(diǎn)針對(duì)絕緣子 1、 絕緣子 2 和絕緣子3的探針， 將稀釋好的標(biāo)記和非標(biāo)記的單鏈探針在95oC 水浴鍋中加熱2分鐘后，關(guān)掉水浴鍋，使溫度自然冷卻，通過退火使兩條單鏈的寡核苷酸鏈互補(bǔ)形成生物素標(biāo)記的雙鏈 DNA 探針。 然后取 20fmol 生物素標(biāo)記的 DNA 探針與 4g 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的核細(xì)胞抽提物在室溫下反應(yīng) 2

60、025 分鐘，用 0.5 TBE 電泳緩沖液，先在100V 恒壓下預(yù)電泳 60 分鐘， 然后將準(zhǔn)備好的樣品加到 6非變性的聚丙烯凝膠上樣孔里，100V 恒壓下電泳 60 分鐘，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。隨后采用同Western blot 相同的濕法轉(zhuǎn)膜將聚丙烯凝膠上的探針，蛋白，以及探針蛋白復(fù)合物一同轉(zhuǎn)移到尼龍膜上（約 100V，60 分鐘），利用超凈工作臺(tái)內(nèi)的紫外燈進(jìn)行紫外交聯(lián)。通過生物化學(xué)發(fā)光法，放射自顯影檢測(cè) CTCF 和特定的 DNA 序列的結(jié)合情況。對(duì)于 RNA-EMSA 實(shí)驗(yàn)，具體詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟與如上所述的 DNA-EMSA 實(shí)驗(yàn)過程相似，不同的是反應(yīng)樣品的制備是用 125nmol