WB實(shí)驗(yàn)步驟詳解

1、精品文檔Western 實(shí)驗(yàn)步驟Western ，也稱 Western blot、 Western blotting、Western 印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western 可以參考如下步驟進(jìn)行操作。1.收集蛋白樣品 (Protein sample preparation)可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例如碧云天生產(chǎn)的Western 及 IP 細(xì)胞裂解液 (P0013) 、RIPA 裂解液等，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白

2、與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(P0028) 。收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的Western 及 IP 細(xì)胞裂解液或RIPA 裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。2.電泳 (Electrophoresis)(1) SDS-PAGE 凝膠配制SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(P0012

3、A) 。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。(2) 樣品處理在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X 或 5X 的 SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X 的 SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。 5X 的 SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(P0015) 。100或沸水浴加熱3-5 分鐘，以充分變性蛋白。(3) 上樣與電泳冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔

4、內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(P0066) 。電泳時(shí)電泳液可以使用碧云天生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液 (P0014A/P0014B) 。電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V ，高電壓可以設(shè)置在120V 左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用碧云天的多功能電泳儀( 帶定時(shí) )(EEP102) 。為了電泳方便起見，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在10

5、0V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為 90120 分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。3.轉(zhuǎn)膜 (Transfer)我們推薦在 Western 實(shí)驗(yàn)中選用 PVDF膜 (FFP30/FFP33) 。硝酸纖維素膜 (NC 膜)(FFN06/FFN09) 也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。通常如果使用Bio-Rad 的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-6

6、0 分鐘。也可以在15-20mA 轉(zhuǎn)膜過夜。轉(zhuǎn)膜時(shí)也可以使用碧云天的多功能電泳儀( 帶定時(shí) )(EEP102) 。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2 條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。1歡迎下載精品文檔轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液 (P0022) 對膜進(jìn)行染色， 以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。 也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液 (P0017) 對完成轉(zhuǎn)膜的 S

7、DS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。4.封閉 (Blocking)轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的 Western 洗滌液 (P0023C) 中，漂洗 1-2 分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。用微型臺式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等吸盡洗滌液，加入 Western 封閉液 (P0023B) ，在搖床上緩慢搖動 , 室溫封閉 60 分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以 4封閉過夜。在整個(gè) Western 過程中我們推薦使用碧云天的側(cè)擺搖床 (ESHK02)或類似儀器，側(cè)向擺動速度比較緩慢

8、，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。5.一抗孵育 (Primary antibody incubation)參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western 一抗稀釋液 (P0023A) 稀釋一抗。用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以4緩慢搖動孵育過夜。或更據(jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r(shí)間?；厥找豢?。加入 Western 洗滌液 (P0023C) ，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

9、注：Western 結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照， 通?？梢赃x用 Tubulin 抗體 (AT819) 或 Actin 抗體 (AA128) ，進(jìn)行內(nèi)參檢測。6.二抗孵育 (Secondary antibody inucubation)參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western 二抗稀釋液 (P0023D) 稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG 的二抗，如辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216) 。碧云天有多種二抗提供。用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4在側(cè)擺

10、搖床上緩慢搖動孵育一小時(shí)?；厥斩?。加入 Western 洗滌液 (P0023C) ，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。7.蛋白檢測 (Detection of proteins)參考相關(guān)說明書，使用BeyoECL Plus(P0018) 等 ECL 類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用專用的壓片暗盒(FFC58/FFC83) 進(jìn)行。洗片時(shí)可以使用X 光片自動洗片機(jī)。如果沒有自動洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒(P0019/P0020) 自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X 光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)專用柯達(dá)X-OMAT BT 膠片(FF0