第九章__植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其在育種中的應(yīng)用

1、植物組織培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代植物植物組織培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代植物生物技術(shù)的基本技術(shù)。生物技術(shù)的基本技術(shù)。（一）生物技術(shù)概念（一）生物技術(shù)概念 生物技術(shù)（生物技術(shù)（Biotechnology)，有時也，有時也稱生物工程（稱生物工程（Bioengineering）, 是指人們是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的原理，按照預(yù)技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料，為人類產(chǎn)出所需產(chǎn)品。生物技術(shù)是一門綜合人類產(chǎn)出所需產(chǎn)品。生物技術(shù)是一門綜合性學(xué)科?，F(xiàn)代生物技術(shù)已成功地應(yīng)用于植性學(xué)科。

2、現(xiàn)代生物技術(shù)已成功地應(yīng)用于植物育種中。物育種中。1.基因工程（基因工程（Gene Engineering）2.細(xì)胞工程（細(xì)胞工程（Cell Engineering ）3.酶工程（酶工程（Enzyme Engineering ）4.發(fā)酵工程（發(fā)酵工程（Fermentation Engineering ）5.蛋白質(zhì)工程（蛋白質(zhì)工程（Protein Engineering ） 細(xì)胞工程就是在細(xì)細(xì)胞工程就是在細(xì)胞水平研究開發(fā)、胞水平研究開發(fā)、利用各類細(xì)胞的工利用各類細(xì)胞的工程。亦即人們根據(jù)程。亦即人們根據(jù)科學(xué)設(shè)計改變細(xì)胞科學(xué)設(shè)計改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，通過的遺傳基礎(chǔ)，通過無菌操作，大量培無菌操作，大量培養(yǎng)

3、細(xì)胞、組織乃至養(yǎng)細(xì)胞、組織乃至完整個體的技術(shù)。完整個體的技術(shù)。1.分離基因的技術(shù)；分離基因的技術(shù)；2.擴(kuò)增基因的技術(shù)；擴(kuò)增基因的技術(shù)；3.將單一細(xì)胞擴(kuò)增成細(xì)胞群體的技術(shù)；將單一細(xì)胞擴(kuò)增成細(xì)胞群體的技術(shù)；4.將一個生命體復(fù)制成一個與之完全相同將一個生命體復(fù)制成一個與之完全相同的新個體的過程；的新個體的過程；5.將單一個體擴(kuò)增成一個遺傳上完全相同將單一個體擴(kuò)增成一個遺傳上完全相同的群體。的群體。6.一個遺傳上來源完全相同的生物群體一個遺傳上來源完全相同的生物群體。1、植物細(xì)胞的全能性（、植物細(xì)胞的全能性（Cell Totipotency） 一個植物細(xì)胞能產(chǎn)生一個完整植株一個植物細(xì)胞能產(chǎn)生一個完整植

4、株的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。2、植物離體分化的類型、植物離體分化的類型無菌短枝型無菌短枝型叢生芽增殖型叢生芽增殖型器官發(fā)生型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球莖發(fā)生型原球莖發(fā)生型3、植物組織培養(yǎng)的特點、植物組織培養(yǎng)的特點培育材料經(jīng)濟(jì)；培育材料經(jīng)濟(jì)；培養(yǎng)條件可人為控制；培養(yǎng)條件可人為控制；生長周期短，繁殖率高；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于自動化控制。管理方便，利于自動化控制。5、植物組織培養(yǎng)的基本操作、植物組織培養(yǎng)的基本操作無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)v接種用具的滅菌接種用具的滅菌 接種前，必須把用

5、具放入接種室或箱內(nèi)，初用接接種前，必須把用具放入接種室或箱內(nèi)，初用接種室或箱時要用甲醛（一般市售分析純的有效成份為種室或箱時要用甲醛（一般市售分析純的有效成份為 36-38% 熏蒸熏蒸5小時以上再開紫外光燈照射小時以上再開紫外光燈照射40-60分鐘，分鐘，以后在每次接種之前，把要接種的試管或三角瓶放入以后在每次接種之前，把要接種的試管或三角瓶放入接種室（箱）內(nèi)，用接種室（箱）內(nèi)，用5%的煤酚瓶皂溶液即來蘇爾（一的煤酚瓶皂溶液即來蘇爾（一般市售的有效成份為般市售的有效成份為47-53%）或）或 5% 的石灰炭酸液噴的石灰炭酸液噴霧消毒，再打開紫外光燈照霧消毒，再打開紫外光燈照20-40分鐘，這樣

6、消毒后，分鐘，這樣消毒后，再經(jīng)再經(jīng)30-40分鐘便可進(jìn)行接種。分鐘便可進(jìn)行接種。 v接種材料的表面滅菌接種材料的表面滅菌 接種前花蕾或穗的徹底滅菌是杜絕污染的主接種前花蕾或穗的徹底滅菌是杜絕污染的主要關(guān)鍵，先用要關(guān)鍵，先用70-75%的酒精浸泡的酒精浸泡10-15秒鐘或用秒鐘或用酒精棉球擦兩遍，初步殺死表面所帶的微生物，酒精棉球擦兩遍，初步殺死表面所帶的微生物，放在放在10%的漂白粉液或飽和漂白粉液中浸泡的漂白粉液或飽和漂白粉液中浸泡15-30分鐘殺菌，然后用無菌水沖洗分鐘殺菌，然后用無菌水沖洗2-3次。次。 消毒過的穗子或花蕾用消毒紗布包好，待取消毒過的穗子或花蕾用消毒紗布包好，待取花藥接種

7、，注意，穗子或花蕾的操作要在無菌條花藥接種，注意，穗子或花蕾的操作要在無菌條件下進(jìn)行。件下進(jìn)行。5、植物組織培養(yǎng)所需營養(yǎng)與環(huán)境條件、植物組織培養(yǎng)所需營養(yǎng)與環(huán)境條件（1）無機營養(yǎng)）無機營養(yǎng)大量元素：大量元素： 一般是指濃度大于一般是指濃度大于0.5mmol/L.氮氮(N) 、磷、磷(P) 、鉀鉀(K) 、鈣、鈣(Ca) 、鎂、鎂(Mg) 、硫、硫(S) 。微量元素：微量元素： 包括鐵包括鐵(Fe) 、銅、銅(Cu) 、鉬、鉬(Mo) 、鋅、鋅(Zn) 、鈉鈉(Na) 、錳、錳(Mn) 、鈷、鈷(Co) 、硼、硼(B) 、碘、碘(I)。（2）有機營養(yǎng)）有機營養(yǎng)維生素、肌醇、氨基酸、有機添加物。維生

8、素、肌醇、氨基酸、有機添加物。（3）生長調(diào)節(jié)物）生長調(diào)節(jié)物生長素生長素：2，4 - D、奈乙酸、奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（、吲哚丁酸（IBA）、）、吲哚乙酸吲哚乙酸(IAA) 。細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素：激動素（：激動素（KT）、）、6-芐基氨基嘌呤（芐基氨基嘌呤（6BA） 、玉米素玉米素（ZT）。）。赤霉素赤霉素（GA） ：脫落酸（：脫落酸（ABA） 、乙烯利（、乙烯利（CEDP）。）。（4）瓊脂）瓊脂（5）能源和滲透壓）能源和滲透壓（6）其他成分）其他成分（7）溫度）溫度（8）光照（光強、光質(zhì)）光照（光強、光質(zhì)）培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基的配制： 培養(yǎng)基母液的配制培養(yǎng)基母液的配制 ；配制培養(yǎng)基的步

9、驟；配制培養(yǎng)基的步驟；培養(yǎng)基的分裝及滅菌。培養(yǎng)基的分裝及滅菌。6、植物組織培養(yǎng)經(jīng)歷的五個階段：、植物組織培養(yǎng)經(jīng)歷的五個階段：（1）預(yù)備階段預(yù)備階段外植體的獲得；外植體的獲得；接種材料的消毒處理；接種材料的消毒處理；配制適宜的培養(yǎng)基；配制適宜的培養(yǎng)基；（2）誘導(dǎo)去分化階段誘導(dǎo)去分化階段（3）繼代增殖階段）繼代增殖階段（4）生根成芽階段）生根成芽階段（5）移栽成活階段）移栽成活階段種質(zhì)資源保護(hù)；種質(zhì)資源保護(hù)；優(yōu)良品種快速繁殖；優(yōu)良品種快速繁殖；誘發(fā)和離體篩選突變體；誘發(fā)和離體篩選突變體；克服遠(yuǎn)緣雜交困難；克服遠(yuǎn)緣雜交困難；克服種子發(fā)育中的障礙；克服種子發(fā)育中的障礙；單倍體育種的技術(shù)環(huán)節(jié)單倍體育種的

10、技術(shù)環(huán)節(jié)基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)1.單倍體的概念及其特點單倍體的概念及其特點 只含有一套染色體組的生物體；只含有一套染色體組的生物體； 被子植物的配子體世代。被子植物的配子體世代。矮小性；矮小性；不育性；不育性；全顯性。全顯性。1.單倍體植物的直接利用；單倍體植物的直接利用；2.克服雜種分離，縮短育種年限；克服雜種分離，縮短育種年限；3.快速獲得異花授粉植物的自交系；快速獲得異花授粉植物的自交系；4.單倍體植物的誘變育種；單倍體植物的誘變育種；5.克服遠(yuǎn)緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現(xiàn)象；克服遠(yuǎn)緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現(xiàn)象；（1）單倍體材料的采集）單倍體材料的采集 單倍體育種的首要問題是如何

11、獲得大最的單單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單倍體植株。據(jù)現(xiàn)有的研究材料，用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生倍體植株。據(jù)現(xiàn)有的研究材料，用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株有兩個途徑單倍體植株有兩個途徑: 第一是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉經(jīng)過類似第一是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉經(jīng)過類似胚胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、胚胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、曼陀羅等。曼陀羅等。 第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。（2）花藥的接種）花藥的接種v接種前的準(zhǔn)備工作接種前的準(zhǔn)備工作 接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下

12、進(jìn)行的，所接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下進(jìn)行的，所用的一切用具必須徹底滅菌。用的一切用具必須徹底滅菌。v花粉發(fā)育時期的鑒定花粉發(fā)育時期的鑒定 適宜的花粉發(fā)育時期對于提高花粉誘導(dǎo)愈傷適宜的花粉發(fā)育時期對于提高花粉誘導(dǎo)愈傷組織分化的頻率是很重要的，為此，進(jìn)行花藥組織分化的頻率是很重要的，為此，進(jìn)行花藥培養(yǎng)前，要用顯微鏡進(jìn)行花粉發(fā)育時期的鑒定。培養(yǎng)前，要用顯微鏡進(jìn)行花粉發(fā)育時期的鑒定。 經(jīng)顯微鏡檢查后，把花粉細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)期與經(jīng)顯微鏡檢查后，把花粉細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)期與花藥或花序的外部形態(tài)聯(lián)系起來，找出花粉單花藥或花序的外部形態(tài)聯(lián)系起來，找出花粉單核期或單核期的花蕾或花序的外部形態(tài)標(biāo)志選核期或單核期的花蕾或花

13、序的外部形態(tài)標(biāo)志選取花藥進(jìn)行接種培養(yǎng)。取花藥進(jìn)行接種培養(yǎng)。 誘導(dǎo)愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在誘導(dǎo)愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在愈傷組織長到愈傷組織長到1-3毫米大?。ㄈ缧∶状螅r，即毫米大?。ㄈ缧∶状螅r，即可轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株。可轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株。一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然會發(fā)生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此，會發(fā)生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此，掌握芽分化的條件是十分重要的。掌握芽分化的條件是十分重要的。 愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)工作是在無菌室或接種愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)工作是在

14、無菌室或接種箱內(nèi)進(jìn)行的，轉(zhuǎn)移后愈傷組織培養(yǎng)在箱內(nèi)進(jìn)行的，轉(zhuǎn)移后愈傷組織培養(yǎng)在23-28恒恒溫室內(nèi)，每日光照溫室內(nèi)，每日光照9-11小時，可用日光燈作輔助小時，可用日光燈作輔助光，光強度在光，光強度在2000勒克斯以上。勒克斯以上。 在轉(zhuǎn)移愈傷組織時，應(yīng)注意其極性，原來在轉(zhuǎn)移愈傷組織時，應(yīng)注意其極性，原來向上的一但轉(zhuǎn)移后的一但轉(zhuǎn)移后仍應(yīng)向上，否則向上的一但轉(zhuǎn)移后的一但轉(zhuǎn)移后仍應(yīng)向上，否則會影響生長，同時在轉(zhuǎn)移時，就避免沾帶過多的會影響生長，同時在轉(zhuǎn)移時，就避免沾帶過多的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。 處理方式：處理方式：l試管內(nèi)進(jìn)行；試管內(nèi)進(jìn)行；l花粉植株定植后進(jìn)行；花粉植株定植后進(jìn)行；藥劑處理；藥劑處理；植

15、株鑒定。植株鑒定。 （二）原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交 常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越的天然屏障而舉步維艱。的天然屏障而舉步維艱。 科學(xué)家們受細(xì)科學(xué)家們受細(xì)胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，逐漸將眼光轉(zhuǎn)向細(xì)胞融合，試圖通過這逐漸將眼光轉(zhuǎn)向細(xì)胞融合，試圖通過這種嶄新的手段沖破自然界的禁錮種嶄新的手段沖破自然界的禁錮。1.原生質(zhì)體的概念原生質(zhì)體的概念 植物細(xì)胞原生質(zhì)體是指那些以去除植物細(xì)胞原生質(zhì)體是指那些以去除全部細(xì)胞壁的細(xì)胞。全部細(xì)胞壁的細(xì)胞。 此時，細(xì)胞外僅由此時，細(xì)胞外僅由細(xì)胞膜包裹，細(xì)胞膜包裹， 呈圓

16、形只有在高滲溶液中呈圓形只有在高滲溶液中才能相對穩(wěn)定。才能相對穩(wěn)定。 原生質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)處理，可與其他細(xì)原生質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)處理，可與其他細(xì)胞融合成新的體細(xì)胞胞融合成新的體細(xì)胞。比完整的細(xì)胞更容易獲得外來遺傳物質(zhì)，比完整的細(xì)胞更容易獲得外來遺傳物質(zhì)，為實現(xiàn)異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了較好的為實現(xiàn)異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了較好的實驗材料。實驗材料。原生質(zhì)體在一定條件下可以融合成雜種原生質(zhì)體在一定條件下可以融合成雜種細(xì)胞，開辟了一條新的育種途徑。細(xì)胞，開辟了一條新的育種途徑。1892， J. A. Klerker 用機械法獲得原生質(zhì)體；用機械法獲得原生質(zhì)體；1960，E.C. Cocking 用酶法首先從番茄根尖中分

17、離出用酶法首先從番茄根尖中分離出大量有活性的原生質(zhì)體并通過培養(yǎng)再生出細(xì)胞壁大量有活性的原生質(zhì)體并通過培養(yǎng)再生出細(xì)胞壁形成再生植株形成再生植株;1960，G. Barski發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn), 題細(xì)胞原生質(zhì)體能融合在一起題細(xì)胞原生質(zhì)體能融合在一起形成單核的、并能進(jìn)行分裂的雜種細(xì)胞；形成單核的、并能進(jìn)行分裂的雜種細(xì)胞；1972，P.S.Carlon首次獲得煙草體細(xì)胞種間雜種。首次獲得煙草體細(xì)胞種間雜種。80s 此項技術(shù)在我國得到發(fā)展。此項技術(shù)在我國得到發(fā)展。4. 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備（1）取材與滅菌）取材與滅菌（2）酶解）酶解 (纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶) （3）分離

18、）分離 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）（沉淀法、漂洗法、滴洗法）（4）洗滌）洗滌（5）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：原生質(zhì)體的培養(yǎng)：細(xì)胞壁再生；細(xì)胞壁再生；細(xì)胞分裂；細(xì)胞分裂；植株再生。植株再生。5. 原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體的融合v化學(xué)法誘導(dǎo)融合化學(xué)法誘導(dǎo)融合1)按比例混合雙親原生質(zhì)體按比例混合雙親原生質(zhì)體- 2)滴加滴加PEG- 3)滴加高鈣高滴加高鈣高PH值溶液值溶液- 4)洗滌原生質(zhì)體溶液洗滌原生質(zhì)體溶液- 5)離心獲得原生質(zhì)體溶液離心獲得原生質(zhì)體溶液-6)篩選雜種細(xì)胞篩選雜種細(xì)胞-7)再生雜種細(xì)胞再生雜種細(xì)胞。v物理法誘導(dǎo)融合物理法誘導(dǎo)融合基本程序：基

19、本程序：l原生質(zhì)體的獲得；原生質(zhì)體的獲得；l電擊融合；電擊融合；l篩選雜種細(xì)胞；篩選雜種細(xì)胞；l雜種細(xì)胞再生和完雜種細(xì)胞再生和完整植株的形成。整植株的形成。6. 融合細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定與篩選融合細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定與篩選雜和細(xì)胞的顯微鏡鑒別；雜和細(xì)胞的顯微鏡鑒別；互補法鑒定雜和細(xì)胞；互補法鑒定雜和細(xì)胞；細(xì)胞與分子生物學(xué)法；細(xì)胞與分子生物學(xué)法；植株形態(tài)的鑒別。植株形態(tài)的鑒別。（三）人工種子（三）人工種子 人工種子即人為制造的種子，它人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素、及其他成分的人工膠囊。分、激素、及其他成分的人工膠囊。其具有種子的功能，可

20、直接用于田間其具有種子的功能，可直接用于田間播種。播種。 1、人工種子的構(gòu)成人工種子的構(gòu)成 人工種皮人工種皮 胚胚 狀狀 體體 人工胚乳人工胚乳2、人工種子的特點人工種子的特點：（1）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進(jìn)行生產(chǎn)；）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進(jìn)行生產(chǎn)；（2）經(jīng)人工無性繁殖產(chǎn)生，有利于保存該種系）經(jīng)人工無性繁殖產(chǎn)生，有利于保存該種系 的優(yōu)良性狀；的優(yōu)良性狀；（3）成本低，適于田間機械化生產(chǎn)；）成本低，適于田間機械化生產(chǎn)；（4）可根據(jù)需要調(diào)節(jié)胚乳成分）可根據(jù)需要調(diào)節(jié)胚乳成分。3、人工種子的制備人工種子的制備（1）胚狀體的制備及其同步生長；）胚狀體的制備及其同步生長；（2）人工胚乳的制備；）人工胚乳的制備；（3）配制包埋劑及人工包埋。）配制包埋