X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序原理和文庫構(gòu)建注意要點PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序原理和文庫構(gòu)建注意單細胞轉(zhuǎn)錄組測序原理和文庫構(gòu)建注意要點要點目 錄l 10X單細胞轉(zhuǎn)錄組簡介l 10X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的技術(shù)要點l 10X單細胞外出試驗流程l 10X單細胞建庫流程l 常見問題第1頁/共11頁10X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序簡介 10 x Genomics 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的技術(shù)核心利用微流控芯片對細胞進行精確區(qū)分，通過10 x Barcodes標(biāo)記每一個細胞，能實現(xiàn)大規(guī)模的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，從而更高分辨率地揭示細胞間的細胞差異以及其在微環(huán)境中的功能情況，在細胞異質(zhì)性研究中表現(xiàn)出色。 研究領(lǐng)域細胞異質(zhì)性研究免疫反應(yīng)定點編輯基因的細胞水平研究發(fā)育及分化新型細胞發(fā)現(xiàn)

2、構(gòu)建細胞圖譜 技術(shù)優(yōu)勢不需要微量擴增，降低假陽性率靈活的獲取量，可一次性對500-10000個細胞建庫，提高效率7分鐘之內(nèi)即可完成單細胞體系制備，捕獲效率高達65成本低，廣泛的研究應(yīng)用領(lǐng)域，超短的項目周期 細胞類型生殖細胞、胚胎細胞、神經(jīng)細胞、免疫細胞、腫瘤細胞、干細胞、其他原代細胞第2頁/共11頁10X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的技術(shù)原理10X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序：是如何實現(xiàn)單個細胞的分離的？是如何區(qū)分不同的細胞以及同一細胞中同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本的呢？微流控技術(shù)Barcoding技術(shù)第3頁/共11頁Barcoding技術(shù)第4頁/共11頁流式分選組織解離10X單細胞外出試驗流程a/ 細胞懸液制備（客戶完成）

3、 細胞懸浮緩沖液：1XPBS with 0.04%BSA 細胞濃度范圍：700-1200 cells/ul 細胞活性：80% 血液提取、磁珠純化、流式分選、組織解離等。b/細胞活性和濃度的測定 用臺盼藍對細胞進行染色，用細胞計數(shù)儀進行細胞活 性和濃度的計數(shù)；細胞懸液不宜在冰上放太久，30分 鐘內(nèi)使用最佳。c/準(zhǔn)備單細胞Master Mix 提前將試劑拿出化凍備用，在冰上配置Master Mix。d/組裝芯片 手持芯片邊緣將芯片放入芯片架，樣本數(shù)不足8個， 需要向用不到的通道內(nèi)加入50%甘油，不要向回收 孔中加入50%的甘油 第5頁/共11頁f/ 將Master Mix，水和細胞的混合物，Gel

4、 Beads以及 Partitioning Oil加入芯片中 按-的順序分別添加 樣品和Master Mix、Gel Beads和Partitioning Oil。要盡量減少芯片裝載和運行 的間隔時間。e/ 混合單細胞懸液、aster ix和水 根據(jù)目標(biāo)捕獲細胞數(shù)和細胞濃度確定上樣體積和水 的體積，先向Mix中加入水再加細胞懸液，細胞懸液 加入aster ix前用移液器重懸細胞懸液。不要直接 混合細胞和水。第6頁/共11頁g/運行Chromium Controllerh/轉(zhuǎn)移GEMs 槍頭不要緊貼孔的底部，同時避免產(chǎn)生氣泡， 取出移液器，確保吸頭中沒有氣泡產(chǎn)生i/用回收溶液破裂GEMs第7頁/

5、共11頁10X單細胞文庫構(gòu)建片段化、末端修復(fù)加A尾SPRI磁珠雙端純化接頭連接接頭后純化Index PCRSPRI磁珠雙端純化預(yù)先設(shè)定好PCR儀到4，在冰上準(zhǔn)備片段化反應(yīng)體系。吸液體積要準(zhǔn)確，取上清（去大）和去上清（去?。┒疾灰酱胖?，使用新配的80%乙醇，磁珠晾干時間不超過1min。冰上配置接頭Mix同上一步雙端純化根據(jù)建庫起始量計算循環(huán)數(shù)，Index 核對無誤。第8頁/共11頁常見問題Q1:細胞懸液中雜質(zhì)較多，一方面會影響計數(shù)的不準(zhǔn)確，細胞濃度偏高，細胞活性偏低； 另一方面會導(dǎo)致芯片的堵塞。Q2：細胞直徑較?。?um），不在計數(shù)儀有效計數(shù)的大小范圍；細胞小，染色后容易 被當(dāng)成死細胞計數(shù)，導(dǎo)致細胞活性比實際的活性低。Q3：GEMs生成