細胞培養(yǎng)-復蘇,傳代換液,凍存計數(shù)(自編)

1、細胞培養(yǎng)程序材料A、儀器1. 凈化工作臺，2. 離心機，3. 恒溫水浴箱，4. 冰箱（4）5. 倒置相差顯微鏡，6. CO2培養(yǎng)箱，7. 振蕩混合儀8. 酶聯(lián)免疫檢測儀，9. 移液槍，10. 電磁力攪拌機，11. 微孔濾器B、玻璃器皿1. 吸管，2. 小燒杯（100ml），3. 廢液缸，C、塑料器皿1. 吸頭，2. 槍頭，3. 96孔培養(yǎng)板，4. 15ml離心管，5. 50ml離心管，6. 膠塞，D、其他物品 1. 微量加樣槍，2. 紅血球計數(shù)板，F(xiàn)、試劑1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，4. 雙抗（青霉素、鏈霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025% EDT

2、A 7. 二甲基亞砜（DMSO），8. MTT溶液：稱取250mgMTT，放入小燒杯中，加50ml培養(yǎng)液或平衡鹽溶液在電磁力攪拌機上攪拌30min，用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4保存?zhèn)溆茫瑑芍軆扔行?。一、原代細胞培養(yǎng)或細胞株（系）復蘇培養(yǎng)：（一）細胞原代培養(yǎng)1.貼壁細胞培養(yǎng)法：1）、組織塊培養(yǎng)法 將所取得的組織用含青霉素、鏈霉素400U/ml和400ug/ml的生理鹽水漂洗2遍，5分鐘/次。取出組織盡可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加兩滴小牛血清，用剪刀盡可能將其剪碎，用吸管將其泥狀的組織點種在培養(yǎng)瓶壁，倒置于37°、5%CO2條件下30分鐘后將培養(yǎng)瓶正置，從培養(yǎng)瓶的一端緩緩

3、加入完全培養(yǎng)液（小牛血清15%、青霉素、鏈霉素各100U、100ug/ml），使組織塊有培養(yǎng)液與其接觸為準，輕輕放置于37°培養(yǎng)。待24小時候補液?；蛐K放置后,輕輕翻轉培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶內加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶傾斜放置在37溫箱內。 培養(yǎng)24小時，待小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉平放，靜置培養(yǎng)，動作要輕，嚴禁搖動和來回振蕩，以防由于沖動而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗，若組織塊不易貼壁可預先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時培養(yǎng)基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養(yǎng)24小時后再補液，培養(yǎng)35天時可換液，一方面補充營養(yǎng)，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用

4、。其他方法：消化分離法 、器官培養(yǎng) 略2.懸浮細胞培養(yǎng)法 對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。 （二）細胞株(系)細胞復蘇培養(yǎng)細胞復蘇的主要操作步驟(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。(2)迅速放入38水浴中，并不時搖動，在1分鐘內使其完全融化。(3) 然后在無菌下取出細胞。凍存管用75%酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。(4)在1000r/min速度下離心510分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種

5、濃度1×109/L，置37溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代?；驘o需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)1224小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。加入的培養(yǎng)液的量依凍存的細胞數(shù)量，如果凍存數(shù)量為106，則稀釋10倍使細胞達到105即可。注意事項在細胞復蘇操作時，應注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段(-50)。這樣復蘇的凍存細胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉，再補以

6、適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的結果。二、細胞維持培養(yǎng)（細胞換液培養(yǎng)）、培養(yǎng)選拔常規(guī)觀察 (一)原代細胞的維持1、貼壁細胞（包括半貼壁細胞的換液） 一般三天后組織塊周圍即可見梭形細胞長出。第三天換液一次，其換液方法比較簡單，即棄去舊液，加入與原培養(yǎng)液相同的等量完全培養(yǎng)基。若希望細胞能在較長時間內能維持存活，但不需增殖，此時要換成含2%小牛血清的維持液。 待不同組織塊周圍的細胞連接成片時即可傳代。2、懸浮細胞 凡經(jīng)培養(yǎng)后只在細胞培養(yǎng)基中懸浮生長而不貼壁的細胞，需在倒置顯微鏡下方可觀察到細胞的形態(tài)和生長現(xiàn)象，淋巴細胞的短期培養(yǎng)無需換液，但加入生長因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM

7、、LPS等）后，細胞不僅會發(fā)生轉化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細胞的營養(yǎng)需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細胞不適宜生長，需進行換液。白血病細胞或淋巴瘤細胞體外長期培養(yǎng)時，都需換液培養(yǎng)，待達到飽和密度時才能傳代。換液時，只能采用半量換液的方式，千萬不能采取倒去舊液加入新液的方式進行換液。 半量換液的方法如下： 將原培養(yǎng)瓶豎起，在30分鐘內，若細胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基。若細胞不能沉于瓶底，可吸出細胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮完全培養(yǎng)基，混勻后再轉入原瓶繼續(xù)培養(yǎng)。 （二）傳代細

8、胞維持培養(yǎng)：同上（三）培養(yǎng)選拔常規(guī)觀察：1.培養(yǎng)液 2.細胞生長情況 3.細胞形態(tài)變化 4.污染情況三、細胞的傳代培養(yǎng)：(1)棄舊培養(yǎng)液：吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。 (2)漂洗：每瓶加入2mL，無鈣、鎂PBS或HANKS液，漂洗貼壁細胞一次后倒掉。（可以省略） (3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細胞表面，在倒置顯微鏡下待1/2細胞變園后加適量完全培養(yǎng)液終止。或細胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時，倒掉消化液，再繼續(xù)作用23分鐘，輕輕搖動，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落

9、下來，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時應立即終止消化）。在37°或25°以上環(huán)境進行消化。 (4)終止：加入完全培養(yǎng)基適量（通常10-20%胎牛血清培養(yǎng)基）5ml，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時要按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細胞的機械損傷。 (5)離心：離心（1100rpm）沉淀細胞（5-10分鐘），去除培養(yǎng)基（含胰酶及EDTA）。(6)計數(shù)：離心前先滴好計數(shù)板待計數(shù)，計算細胞的濃度。(7)傳代或凍存：離心后用完全培養(yǎng)基調整適當?shù)募毎麧舛群笤俜制颗囵B(yǎng)（可1:3至1:5傳代，在25cm2的培

10、養(yǎng)瓶中長滿細胞可達5*106/ml，經(jīng)10倍稀釋每瓶達105/ml即可，25cm2的培養(yǎng)瓶每瓶5ml培養(yǎng)液）?；蛴脙龃嬉赫{整濃度（一般達1*107）凍存。（ 到此步時經(jīng)證實未被細菌或真菌污染，則撤去抗生素，以免對細胞的生長長生不利影響，指原代培養(yǎng)細胞）四細胞凍存：細胞凍存液：20% 小牛血清 10% 二甲基亞砜DMSO 70% 培養(yǎng)液或，10% 二甲基亞砜DMSO 90% 小牛血清操作步驟：選對數(shù)增生期細胞（證明無支原體污染），在凍存前一天換液。按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制成懸液，計數(shù)，使細胞密度達5*107/ml左右，離心，去上清液。（凍存細胞數(shù)量要充分，密度達5*107/ml，在溶后稀釋20倍時

11、，仍能保持5*105ml數(shù)量）。一般25cm2的培養(yǎng)瓶滿瓶才達到105.加入配置好的凍存液，與去上清液相同的量一滴一滴的加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10%二甲亞砜(DMSO)或甘油，可使冰點降低，使細胞內水份在凍結前透出細胞外。（細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO和90-95%原來的細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意由于DMSO稀釋時會釋放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成）分裝于無菌凍存管中，每管1.5ml懸液。旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標志。凍存：冰箱4放2小時，-75過夜，轉

12、液氮保存，4°，0°，-20°各30分鐘（現(xiàn)代分子生物學實驗技術P647），最后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。附件一、培養(yǎng)細胞的生長狀況觀察（一）細胞計數(shù)操作規(guī)程胎盤藍法原理：（產(chǎn)品批號：T8154，T6146和Z35,9629）使用胎盤藍染色決定血細胞總數(shù)和活細胞數(shù)目，胎盤藍是用于染色的多種染料中能被活細胞排斥的一種染料，這種方法的成立是基于活細胞不能被染色：胎盤藍對血清蛋白比細胞蛋白有一種更強的親和力，如果背景太深，在計數(shù)之前細胞應成球狀并重懸在無蛋白的培養(yǎng)基或鹽液中。方法：1、預先在平衡鹽液中懸浮細胞（例如：Hanks平穩(wěn)鹽液HBSS，產(chǎn)品

13、批號：H2513）2、取0.5ml0.4%胎盤藍于一試管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml細胞懸液（稀釋倍數(shù)5）并且混勻，允許放置515分鐘。注意：如果細胞在胎盤藍中暴露時間過長，活細胞也會像死細胞一樣被染上色。3、在血細胞計數(shù)板上蓋上蓋玻片，使用巴斯德毛細吸管或其它合適的器材取少量的胎盤藍細胞懸液于血細胞計數(shù)板上的兩個小室中。將巴斯德毛細吸管小心的靠在蓋玻片邊緣，利用毛細張力充滿小室，不要過度或過少充盈。1）從血細胞計數(shù)板的一個小室開始，計數(shù)中間和四角邊長/mm的正方形中的所有細胞數(shù)（詳見sigmaP1845的圖樣I）死細胞被染成藍色，分別計數(shù)活細胞和死細胞數(shù)。注意：壓線細胞的計數(shù)原則，

14、數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右（詳見sigmaP1845的圖II）2）重復上述步驟計數(shù)第2個小室注意：如果超過10%的細胞成串，應重復全部程序通過吹打務必使細胞在原液中和在胎盤藍細胞懸液中一樣分散，如果在10個正方形方格中細胞數(shù)少于200個或多于500個（2050個細胞/正方形）應重復這個步驟，以調節(jié)細胞稀釋倍數(shù)。3）準備第二份樣品并重新計數(shù)以保證準確4）細胞計數(shù)血細胞計數(shù)板上蓋好蓋玻片的每個正方形（指中央大方格，其長度寬度均為1mm的正方形，與蓋玻片的距離為0.1mm），總體積為0.1mm3或10-4cm3。若1cm3近仍等于1ml，那么每毫升中集中的細胞數(shù)（和細胞總數(shù)）則可以這樣來計算。每毫升細胞

15、數(shù)每個正方形的平均細胞數(shù)´稀釋倍數(shù)´104（10個正方形的細胞計數(shù)）例：如果每個正方形的平均細胞數(shù)是45´5´1042.25´106個細胞/ml總細胞數(shù)每毫升細胞數(shù)´最初的細胞樣品的體積例：2.25´106 (個細胞/ml) ´10ml（最初體積）2.25´107個細胞（總細胞）5）活細胞比例（%）總的活細胞數(shù)（沒染上色的）¸總的細胞（染上色的和沒染上色的）´100例：如果每個正方形中沒染上色的（活的）細胞平均數(shù)是37.5，總活細胞數(shù)(37.5´5´104)活細胞數(shù)

16、/ml´10ml（最初體積）1.875´107個活細胞，活細胞比率（%）1.875´107（活細胞數(shù)）¸2.25´107(總細胞數(shù)) ´10083%.血球計數(shù)板的使用16×25型的計數(shù)板 將計數(shù)室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個中方格（100個小方格）計數(shù)（見圖二）。將每一中格放大，可見25個小格。計數(shù)重復3次，取其平均值。計數(shù)完畢后，依下列公式計算：酵母細胞個數(shù)1mL=100個小方格細胞總數(shù)/ 100 ×400×10000×稀釋倍數(shù)或：4個中格的細胞數(shù)/4×

17、16×10000×稀釋倍數(shù)有一種計數(shù)板的結構為25×16，計算如下：4個中格的細胞數(shù)/4×25×10000×稀釋倍數(shù)（二）.細胞生長曲線（細胞貼壁率、細胞分裂率：略）概念：細胞生長曲線是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中細胞數(shù)目的動態(tài)變化，典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平

18、臺狀的平頂期及退化衰亡4個部分。以存活細胞數(shù)(萬mL)對培養(yǎng)時間(h或d)作圖，即得生長曲線。方法：計數(shù)法：1取生長良好接近匯合的細胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細胞懸液后計數(shù)(見四、細胞傳代培養(yǎng)的實驗步驟)。如是非粘壁細胞，則離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細胞懸液計數(shù)。 2根據(jù)細胞計數(shù)結果按每個小方瓶5×104mL作傳代培養(yǎng)接種細胞，共接種21瓶細胞。324 h后開始計數(shù)細胞，以后每隔24 h計數(shù)一次，每次取3瓶細胞，分別進行計數(shù)。計算平均值。連續(xù)計數(shù)7 d。 4根據(jù)細胞計數(shù)結果，以單位細胞數(shù)(細胞數(shù)mL)為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線。 MTT法：1制備1

19、 mL細胞懸液?？瞻讓φ找? mL培養(yǎng)基代替細胞懸液。加入01 mL MTT于37孵育4 h。使MTT還原為藍紫色甲月贊結晶。 2加1 mL DTW脫色液，37至少靜置30 min(甚至過液)，使甲質顆粒充分溶解。 3吸取200 L該溶解液至96孔板孔中，在酶標儀上讀取OD值，檢測波長570 nm，參考波長630 nm。 4每隔24 h測量一個點，每個點為3個平行樣品的平均值。CCK-8法：略CCK-8法的優(yōu)點： 1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑； 2、CCK-8法能快速檢測； 3、CK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度； 4、CCK-8法的重復性優(yōu)于M

20、TT法； 5、CCK-8法對細胞毒性小； 6、CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。 CCK-8法的缺點: 1、與MTT法相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。 2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。（三）.活選細胞觀察：相差倒置顯微鏡使用：略附件二：細胞裂解液：提取RNA用0.5% SDS 0.1mmol/L EDTA(PH8.0) 10 mmol/L Tris.cl(PH8.0) 20 ug/ml RNaseTE:RNA、DNA溶解用1mmol/L EDTA(PH8.0) 10 mmol/L Tris.cl(PH8.

21、0)附件三.IC50半抑制率實驗：MTT法：MTT原理、步驟、結果分析方法及注意事項：MTT全稱為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長

22、處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。 缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22m濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4 避光保存即可

23、。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4ºC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成

24、的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。PBS配方：Nacl 8gKcl 0.2g Na2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g調pH 7.4定容1LMTT法實驗步驟貼壁細胞：1、收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。2.、5%CO2，37孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但

25、我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況3.、5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7、同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶

26、解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細胞：1、收集對數(shù)期細胞，調節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將補足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測物10ul；細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）。2、置37，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

27、（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。5、同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。注意事項：（1）選擇適當?shù)眉毎臃N濃度。（2）避免血清干擾：一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養(yǎng)液。（3）設空

28、白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。（4）MTT實驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關系，IC50是半抑制率：一定濃度的某種藥物誘導腫瘤細胞凋亡50%，該濃度稱為50%抑制濃度. IC50值可以用來衡量藥物誘導凋亡的能力，即誘導能力越強，該數(shù)值越低,當然也可以反向說明某種細胞對藥物的耐受程度。意思是抑制率50的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！舉個例子：各組濃度

29、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計算公式：Pm=0.95，Pn=0.06，P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1，lgI=lg0.1/0.01=1，lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025 有一個公式可供參考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應

30、率之和Pm:最大陽性反應率Pn:最小陽性反應率抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率 例：用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力,應該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適?根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進行比色測定一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。一般要低于IC50，避免非

31、調亡性殺傷的細胞太多，造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細胞系空白處理的調亡率應低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細胞周期的亞G0峰比較明顯。培養(yǎng)細胞的冷凍保存與復蘇n Polge等人（1949）發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存的細胞具有保護作用，。接下來的重大進展是Luyet（1951）與Lovelock（1953）等多位學者發(fā)現(xiàn)了電解質濃度對貯存細胞的損傷作用。他們的結論是，電解質濃度增大是造成貯存細胞損傷的主要原因。1949年至1960年這一段時間可以稱為冷凍保存的“甘油時期”，這一時期對生物材料的冷凍保存一般都是以甘油作

32、為保護劑。Lovelock（1959）等人發(fā)現(xiàn)了一種新的化學保護劑，這就是人們熟悉的二甲基亞砜（DMSO）。n 冷凍保存與復蘇原理 在低于-700C的超低溫條件下，有機體細胞內部的生化反應極其緩慢，甚至終止。水在低于零度的條件下會結冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內外的水分都會結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。這種因細胞內部結冰而導致的細胞損傷稱為細胞內冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會首先結冰，從而使得未結冰的溶液中電解質濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質分子會受到損壞，細胞便發(fā)生滲

33、漏，在復溫時，大量水分會因此進入細胞內，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質損傷或稱溶液損傷。當溫度進一步下降，細胞內外都結冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內即恢復到常溫，細胞內外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質損傷產(chǎn)生，凍存的細胞經(jīng)復蘇后仍保持其正常

34、的結構和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復溫速率有關。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。 冷凍速率 冷凍速率是指降溫的速度，直接關系到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化：當細胞被冷至-50C時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內外溶液仍未結冰；當被冷至-5-150C之間時，細胞外溶液先出現(xiàn)結冰而細胞內仍保持未結冰狀態(tài)。細胞內未結冰的水分子會比細胞外部分結冰溶液中的水分子具有更高的化學能。其結果是，細胞內水分子為了和細胞外水分子保持化學能的平衡，會向細胞外流動。冷凍速度不同，細胞內水分向外流動的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細胞內水分外滲多

35、，細胞脫水，體積縮小，細胞內溶質濃度增高，細胞內不會發(fā)生結冰；如果冷凍速度快，細胞內水分沒有足夠的時間外滲，結果隨著溫度的下降而發(fā)生細胞內結冰；如果冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯?，則細胞內形成的冰晶非常小或不結冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。不同的冷凍速度既然能使細胞內發(fā)生不同的生理變化，也可以對細胞產(chǎn)生不同的損傷。當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結冰，從而使細胞外未結冰的溶液中溶質濃度增高，產(chǎn)生溶質損傷。當冷凍速度過快時，細胞內水分來不及外滲，會形成較多冰晶，造成細胞膜及細胞器的破壞，產(chǎn)生細胞內冰晶損傷。超快速

36、玻璃化冷凍對細胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細胞內外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不致造成損傷，細胞也不會在高濃度的溶質中長時間暴露而受損。 不同細胞的最適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞的最適冷凍速率分別為1.60C/min、70C/min和2000C/min。細胞與細胞之間的最適冷凍速率可在1.60C3000C/min，故對一種細胞進行冷凍保存之前，首先需要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高的冷凍存活率。 冷凍保存溫度 冷凍保存溫度是指能長期保存細胞的超低溫度，在此溫度下，細胞生化反應極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過長期保存，在復蘇后仍能保持正常的結構和功

37、能。 但從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（-1960C）是 目前最佳的冷凍保存溫度。在-1960C時，細胞的生命活動幾乎完全停止，但復蘇后細胞的結構和功能完好。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-1960C下均可保存十年以上。應用-700C-800C保存細胞，短期內對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細胞存活率明顯降低。在冰點到-400C范圍內保存細胞的效果不佳。復蘇速率 冷凍保護體外培養(yǎng)物，除了必須有最佳的冷凍速率、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復蘇時也必須有最佳的復溫速率，這樣才能保證最后獲得最佳冷凍保存效果。 復溫速率是指在細胞復蘇時溫度升高的速度。復溫速率不當也會降低凍存細胞存

38、活率。一般來說，復溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在370C水浴中，于1-2分鐘內完成復蘇。復溫速度過慢，細胞內往往重新形成較大冰晶而造成細胞損傷。復溫時造成的細胞損傷非常快，往往在極短的時間內發(fā)生。 冷凍保護劑 冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質。冷凍保護劑常常配制成一定的溶液。一般來講，只有紅細胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳動物細胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數(shù)有核哺乳動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中，并以0.

39、36000C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細胞會死亡；而加入甘油冷凍保護劑進行冷凍保存時，98%以上的細胞都可存活。 冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子物質，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內，在細胞內外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷，同時，細胞內水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細胞內結冰，在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預冷，讓甘油或DMSO等成分滲透

40、到細胞內，在細胞內外達到平衡以起到充分的保護作用。目前DMSO的應用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細胞的毒性作用較大，而在40C時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細胞內。所以，凍存時DMSO平衡多在40C下進行，一般需要4060分鐘。 非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護機制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質可以優(yōu)先同溶液中水分子結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從

41、而減輕溶質損傷。 不同的冷凍保護劑有不同的優(yōu)、缺點。目前一般多采用聯(lián)合使用兩種以上冷凍保護劑組成保護液。由于許多冷凍保護劑（如DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復溫后應及時洗滌冷凍保護劑。 n 冷凍保存方法 按照冷凍保護液在凍結后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-700C-800C，然后直接投入液氮進行保存；或者是利用電子計算機程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用

42、多種高濃度的冷凍保護劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護液保護懸浮細胞，直接投入液氮進行凍存的方法。以該中方法凍結的細胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細胞凍存最常用的仍是前一種方法。 非玻璃化凍存方法 ² 主要材料 （1）儀器設備：普通冰箱、-300C低溫冰箱和-700C-800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機、電子計算機程控降溫儀等； （2）凍存管：容量為1ml或1.5ml； （3）冷凍保護液：一般是以9份小牛血清或細胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解； （4）待凍存細胞：各種腫瘤細胞或雜交瘤細胞。 ² 操作過程

43、1. 待凍存細胞懸液的制備 (1) 按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數(shù)； (2) 將細胞懸液以8001000r/min離心5min，去上清夜； (3) 向細胞沉淀物中加入冷凍保護液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1×1061×107個/ml； (4) 按每管11.5ml的量分裝于凍存管內，擰緊管蓋； (5) 再凍存管上做好標記，包括細胞代號及凍存日期。 2. 分級冷凍 (1) 先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（480C），約40min； (2) 接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-100C-200C），約3060min； (3) 將凍存管轉入低溫

44、冰箱（-300C），放置30min左右； (4) 然后將凍存管轉移到超低溫冰箱（-700C-800C），過夜； (5) 最后將凍存管投入液氮保存。 3. 記錄 做好凍存記錄。記錄內容包括凍存日期、細胞代號、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。 凍存結果 如此凍存的細胞，其存活率可達90%以上。 討論 在使用DMSO前，不要對其進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結構，以致降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時最好帶手套。 在將細胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最

45、好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。 應注意控制凍存細胞的質量。既要在凍存前保障細胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細胞才具有凍存價值。另外，在每批細胞凍存一段時間后，要復蘇12管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復蘇時，需要從-1960C的液氮中取出凍存管，立即投入37400C溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險。 玻璃化凍存方法² 主要材料 （1）冷凍保護液：為Hanks平衡鹽溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH調節(jié)pH至7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用。 （2）凍存管：SILASTIC玻璃小管，內徑3mm，外徑4.5mm； （3）設備：液氮儲存罐； （4）待凍存細胞：人類外周血單核細胞。