菌種及培養(yǎng)基滅菌

1、會計學1菌種及培養(yǎng)基滅菌菌種及培養(yǎng)基滅菌 (二)、常用微生物微生物在工業(yè)上的用途很廣，包括化工、醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)、國防、紡織、石油勘探及石油化工等方面。微生物總的10左右。微生物的代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計已超過一千三百多種，而大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的總計不超過一百多種；微生物酶有近干種，而已在工業(yè)上利用的不過四五十種。可見，微生物資源不僅十分豐富，而且可挖掘的潛力還是很大的。 二、種子擴大培養(yǎng)(一)、擴大培養(yǎng)的目的1、現(xiàn)代的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模越來越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾十立方米甚至幾百立方米，要使小小的微生物在幾十小時的較短時間內(nèi)，完成如此巨大的發(fā)酵轉(zhuǎn)化任務，那就必須具備數(shù)量巨大的微生物細胞才行。2、菌種擴大培

2、養(yǎng)的目的就是要為每次發(fā)酵罐的投料，提供相當數(shù)量的代謝旺盛的種子。因為發(fā)酵時間的長短和接種量的大小有關，接種量大，發(fā)酵時間則短。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵罐利用率，并且也有利于減少染菌的機會。要得到純而壯的培養(yǎng)物，而且要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。 (二)、種子罐級數(shù)的確定1、確定原則(1) 種子罐的級數(shù)愈少，愈有利于簡化工藝及控制。級數(shù)少可減少種子罐污染雜菌的機會，減少消毒及值班工作量以及減少因種子罐生長異常而造成發(fā)酵的波動。 (2) 應當考慮到如何才能最低限度地占用發(fā)酵罐中非合成代謝產(chǎn)物的運轉(zhuǎn)周期。所以種子罐級數(shù)的決定取決于菌種的性質(zhì)(如菌種傳

3、代后的穩(wěn)定性)、孢子瓶中的孢子數(shù)、孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度以及發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)液的最低接種量和種子罐與發(fā)酵罐的容積比。如果孢子瓶中的孢子數(shù)量較多，孢子在種子罐中發(fā)育較快，且對發(fā)酵罐的最低接種量的要求亦較小，顯然可采用二級發(fā)酵流程。(3) 種子罐的級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定，也隨著工藝條件的改變作適當?shù)恼{(diào)整。例如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速孢子的發(fā)育或改進孢子瓶的培養(yǎng)工藝后可大大增加孢子數(shù)量等，在此基礎上均有可能使三級發(fā)酵簡化為二級發(fā)酵。 1、實例(1) 放線菌(抗生素生產(chǎn)) 放線菌的細胞生長繁殖速度較慢，常常用三級種子擴大培養(yǎng)，即將種子罐中之菌絲移植到較大的種子罐中擴大培養(yǎng)后，再移入發(fā)酵罐中，

4、這種流程稱為三級發(fā)酵。一般50t發(fā)酵罐多采用三級發(fā)酵，有的甚至采用四級發(fā)酵，如鏈霉素生產(chǎn)。 (2)霉菌（酶制劑）酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)也采用三級發(fā)酵。 (3) 細菌(谷氨酸)谷氨酸及其他氨基酸發(fā)酵所用的菌種是細菌，生長繁殖速度很快，所以采用二級發(fā)酵。二級發(fā)酵的流程如下： 斜面菌種-一級種子搖床培養(yǎng)-二級種子罐培養(yǎng)-發(fā)酵罐 三、種子培養(yǎng)方法 (一)、一級種子培養(yǎng)方法1、 液體培養(yǎng)法：三角瓶搖床振蕩或回轉(zhuǎn)式培養(yǎng)。2、 表面法培養(yǎng)：茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培養(yǎng)。3、 固態(tài)法培養(yǎng)：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培養(yǎng)皿等麩皮培養(yǎng)。 (二)、二級及多級種子培養(yǎng)方法1、固體培養(yǎng) 固體培養(yǎng)又可分為淺盤固體培養(yǎng)和深層固體培養(yǎng)，統(tǒng)

5、稱曲法培養(yǎng)2、液體深層培養(yǎng) 液體深層培養(yǎng)的特點是容易按照生產(chǎn)菌種對于代謝的營養(yǎng)要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度與培養(yǎng)基中氫離子濃度等影響，選擇最佳培養(yǎng)條件，因此，目前幾乎所有好氣性發(fā)酵都采取液體深層培養(yǎng)法?，F(xiàn)在發(fā)酵罐的容積最大為5001000t，溶解氧、溫度、pH值等均有自控儀器。3、載體培養(yǎng) 以天然或人工合成的多孔材料代替麩皮之類的固態(tài)基質(zhì)作為微生物生長的載體，營養(yǎng)成分可以嚴格控制。兩步法液體深層培養(yǎng) 每一步菌體相同而培養(yǎng)條件不同，因為微生物生長與產(chǎn)酶的最適條件往往有很大差異。 四、影響種子質(zhì)量的因素1、培養(yǎng)基(1) 不同類型的微生物所需要的培養(yǎng)基成分與濃度配比并不完全相同，產(chǎn)量提高是

6、選擇培養(yǎng)基的一個重要標準。 (2) 種子罐是培養(yǎng)菌體的，培養(yǎng)基的糖分要少而對微生物生長起主導作用的氮源要多而且其中無機氮源所占的比例要大些。（3) 種子罐和發(fā)酵罐的培養(yǎng)基成分可相同也可不同，相同也有益處。這樣可使處于對數(shù)生長期的菌種移植在適宜的環(huán)境中發(fā)酵，可以大大縮短其生長過程的緩慢期。（4) 對于某一菌種和具體設備條件來說，最適宜的配比完全應該進行多因素的優(yōu)選， 通過對比試驗去確定。如果菌種的特性或設備條件(如罐型、攪拌的形式和轉(zhuǎn)速等)變化較大，則培養(yǎng)基配比應通過試驗相對地變更：只有培養(yǎng)基各成分的關系選得比較恰當，才能最大地發(fā)揮菌種的特性，提高產(chǎn)量2、種齡與接種量（1） 種齡 種子培養(yǎng)期應取

7、菌種的對數(shù)生長期為宜（2） 接種量 大量地接入成熟的菌種，可以縮短生長過程的緩慢期，因而縮短發(fā)酵周期，節(jié)約了發(fā)酵培養(yǎng)的動力消耗，提高了設備利用率，并有利于減少染菌機會。接種量過多也無必要，因種子培養(yǎng)費時，而且過多地移入代謝廢物，反而會影響正常發(fā)酵。 3、溫度 4、pH值 (1) 各種微生物都有自己生長與合成酶的最適pH值。同一菌種合成酶的類型與酶系組成可以隨pH值的改變而產(chǎn)生不同程度的變化。 (2) 氮源被利用后NH3的產(chǎn)生，則pH值上升；陽離子(如NH4 + ，K+)被吸收或有機酸的積累，則pH值下降。一般來說，高碳源培養(yǎng)基傾向于向酸性pH值轉(zhuǎn)移，高氮源培養(yǎng)基傾向于向堿性pH值轉(zhuǎn)移，這都跟碳

8、氮比直接有關。 (3) 必須保持適當?shù)膒H值。調(diào)節(jié)方法有三種，即使用酸堿溶液、緩沖液以及各種生理緩沖劑(如生理酸性與生理堿性的鹽類)。 5、通氣和攪拌(1)、不同微生物要求通氣量不同，即使是同一菌種，不同生理時期對通氣量的要求也不相同。(2)、通氣量與菌種、培養(yǎng)基性質(zhì)以及培養(yǎng)階段有關。(3)、氧溶解的速度大于菌體的吸氧量時，菌體才能正常地生長和合成酶，否則氧的溶解比消耗少，氧的濃度降低，降到某一濃度(稱溶解氧的臨界點)，菌體生長就減慢。(4)、培養(yǎng)罐深、攪拌轉(zhuǎn)速大、通氣管開孔小或多、培養(yǎng)基的粘度越小氧的溶解速度也越大。 6泡沫與染菌（1）泡沫形成原因 通氣和機械攪拌使液體分散和空氣竄入形成氣泡

9、，培養(yǎng)基中某些成分的變化或微生物的代謝活動產(chǎn)生氣泡，培養(yǎng)基中某些成分(如蛋白質(zhì)及其他膠體物質(zhì))的分子在氣泡表面排列形成堅固的薄膜，因此，氣泡不易破裂，聚成泡沫層。 (2) 消泡措施 主要偏重于化學方法和機械消泡。消泡劑有動植物油以及來自石油化工生產(chǎn)的礦物油、改性油、表面活性劑、有機硅聚合物如硅油、硅酮樹脂等。泡沫的控制除了添加消泡劑外，改進培養(yǎng)基成分也是相輔相成的一個重要方面。 (3)染菌原因 設備本身結(jié)構(gòu)存在“死角”、設備、管道、閥門漏損、滅菌不徹底，空氣凈化不好、無菌操作不嚴或菌種不純等問題 二、發(fā)酵過程的促進劑 1、對產(chǎn)酶影響 酶制劑發(fā)酵過程中，某些誘導物、表面活性劑及其他一些產(chǎn)酶促進劑

10、，可以大大增加菌體的產(chǎn)酶量。 添加誘導物，對產(chǎn)誘導酶(如水解酶類)的微生物來說，可使原來很低的產(chǎn)酶量大幅度地提高，這在生產(chǎn)酶制劑新品種時尤其明顯。一般的誘導物是相應酶的作用底物或一些底物類似物，這些物質(zhì)可以“啟動”微生物體內(nèi)的產(chǎn)酶機構(gòu)，如果沒有這些物質(zhì)，這種機構(gòu)通常是沒有活性的，產(chǎn)酶是受阻抑的。 常用的促進劑有各種表面活性劑(洗凈劑、吐溫80、植酸、洗衣粉等)、二乙胺匹乙酸、大豆油精抽提物、黃血鹽、甲醇等。 2、對合成抗生素的影響(1)有的可能起生長因素的作用；(2)有的可推遲菌體的自溶；(3)有的是抑制了某些合成其他產(chǎn)物的途徑而使之向所需產(chǎn)物的途徑轉(zhuǎn)化；(4)有的是降低了產(chǎn)生菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成；(5）有的可改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，改善通氣效果； (6)有的可與抗生素形成復鹽，從而降低發(fā)酵液中抗生素的濃度和促進抗生素的合成。 3、對氨基酸發(fā)酵的影響 （1）防止噬菌體污染。 （2）防止營養(yǎng)缺陷菌株發(fā)生回復突變。 微生物微生物相對抵抗力相對抵抗力細菌與酵母的營養(yǎng)細胞細菌與酵母的營養(yǎng)細胞1細菌孢子細菌孢子3106霉菌孢子霉菌孢子210病毒與噬菌體病毒與噬菌體15溫度（）滅菌時間（min）營養(yǎng)成分破壞(%)溫度（)滅菌時間（min）營養(yǎng)成分破壞(%)10040099.31300.58110