基因工程的基本操作步驟PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定第1頁/共41頁一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因也有一些具有調(diào)控作用的因子也有一些具有調(diào)控作用的因子2 2、獲取目的基因的方法、獲取目的基因的方法（1 1）從基因文庫中獲?。幕蛭膸熘蝎@?。? 2）利用）利用PCRPC

2、R技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增（3 3）人工合成）人工合成_第2頁/共41頁( (一一) )從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因 將含有將含有某種生物不同基因某種生物不同基因的許多的許多DNADNA片斷，片斷，導(dǎo)入到導(dǎo)入到受體菌的群體受體菌的群體中，各個受體菌分別含中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。2.2.基因文庫的分類基因文庫的分類: :種種類類基因組文庫：基因組文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基基因因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，如：基因，如：cDNAcDNA文庫文庫第3頁/共

3、41頁限制酶限制酶拼接到載體上拼接到載體上導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增 基因組文庫基因組文庫3 3. .基因文庫的構(gòu)建方法基因文庫的構(gòu)建方法第4頁/共41頁提取生物某發(fā)育時期的提取生物某發(fā)育時期的mRNAmRNA單單 鏈鏈DNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈C CDNADNA( (只含該生物部分基因只含該生物部分基因) )與載體連接導(dǎo)入到受體菌群儲存與載體連接導(dǎo)入到受體菌群儲存 cDNAcDNA文庫文庫第5頁/共41頁基因組文庫和基因組文庫和cDNAcDNA文庫比較文庫比較第6頁/共41頁原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)( (補(bǔ)充內(nèi)容）補(bǔ)充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)

4、非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動子啟動子終止子終止子不編碼蛋白質(zhì)。不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì)：編碼蛋白質(zhì) , ,連續(xù)不間斷連續(xù)不間斷編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)原核原核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)調(diào)控遺傳信息表達(dá)調(diào)控遺傳信息表達(dá), ,上上 游有啟動子，下游有終止子游有啟動子，下游有終止子第7頁/共41頁真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)

5、上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 真核真核細(xì)胞細(xì)胞的的 基因基因結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用有調(diào)控作用, ,上游有啟動子，下上游有啟動子，下游有終止子游有終止子非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第8頁/共41頁原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)

6、編碼區(qū)非編碼非編碼第9頁/共41頁第10頁/共41頁基因組文庫和基因組文庫和cDNAcDNA文庫比較文庫比較第11頁/共41頁依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息如：根據(jù)基因的核苷酸序列如：根據(jù)基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置 基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA 基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性4.4.從基因文庫中得到目的基因的方法從基因文庫中得到目的基因的方法第12頁/共41頁概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、_、_

7、 _ 、 _ _ 、_ 原理：原理：_聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復(fù)制復(fù)制模板模板DNA DNA 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸DNADNA引物引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶（二）（二）利用利用PCRPCR擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增為擴(kuò)增循循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：_指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)使目的基因的片段在短時間內(nèi)大量大量擴(kuò)增擴(kuò)增第13頁/共41頁過程過程a a、變性、變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作

8、用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、復(fù)性、復(fù)性（復(fù)性復(fù)性55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，）：系統(tǒng)溫度降低，引引 物與物與DNADNA模板結(jié)合模板結(jié)合，形成局部，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈前提前提_ 有有一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列第14頁/共41頁蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列列推測推測推測推測目的基因目的基因化

9、學(xué)合成化學(xué)合成（DNADNA合成儀）合成儀）（三）人工合成（三）人工合成若基因若基因_，核苷酸序列，核苷酸序列_ _ ，可用此法。，可用此法。較小較小已知已知（化學(xué)合成法）（化學(xué)合成法）第15頁/共41頁mRNAmRNAcDcDNANA單鏈單鏈cDNAcDNA分子分子逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶聚合酶（三）人工合成（三）人工合成（反轉(zhuǎn)錄法）（反轉(zhuǎn)錄法） 與直接提取的與直接提取的DNADNA相比相比cDNAcDNA不含有不含有_ 和和_等結(jié)構(gòu)。等結(jié)構(gòu)。第16頁/共41頁第17頁/共41頁a a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在 并遺傳給子代并遺傳給子代b b、

10、同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用、同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用1 1、基因表達(dá)載體的、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的構(gòu)建目的二二、表達(dá)載體的構(gòu)表達(dá)載體的構(gòu)建建第18頁/共41頁2 2、基因表達(dá)載體的組成：、基因表達(dá)載體的組成： 目的基因目的基因 標(biāo)記基因標(biāo)記基因 啟動子啟動子 終止子終止子第19頁/共41頁啟動子：啟動子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾

11、端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是的作用是為了為了鑒別鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來胞篩選出來第20頁/共41頁用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露出_。用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。3 3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 D

12、NADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接酶相同相同 ( (插入式插入式) )第21頁/共41頁用一定的用一定的_切割切割 質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切 口，露出口，露出_。用用_切斷目切斷目 的基因，使其產(chǎn)生的基因，使其產(chǎn)生_ _ _。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質(zhì)粒）分子（重組質(zhì)粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶的黏性末端的黏性末端切口

13、切口DNADNA連接酶連接酶相同相同用同種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，使之用同種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，使之露出相同的露出相同的黏性末端黏性末端，在加入，在加入DNADNA連接酶。連接酶。第22頁/共41頁三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胫参锛?xì)胞植物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)雱游锛?xì)胞動物細(xì)胞將目的基因?qū)雽⒛康幕驅(qū)胛⑸锛?xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法CaCa+ +處理法處理法第23頁/共41頁1 1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：

14、易感染雙子葉植物和裸子植物，對大易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力多數(shù)單子葉植物沒有感染能力原理：原理：農(nóng)桿菌特點(diǎn)：農(nóng)桿菌特點(diǎn)：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法TiTi質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的T-DNAT-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNADNA上。上。第24頁/共41頁過程：過程：1、將目的基因插入到、將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA上上2、將重組、將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌3、用農(nóng)桿菌感染植物體細(xì)胞、用農(nóng)桿菌感染植物體細(xì)胞第25頁/共41頁（2 2）基因槍法）基因槍法第26頁/共41頁第

15、27頁/共41頁方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序：取卵取卵顯微注射顯微注射受精卵受精卵早期胚胎培養(yǎng)早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植胚胎移植第28頁/共41頁3 3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用用CaCa2+2+處理細(xì)處理細(xì)胞胞 原核生物特點(diǎn)：原核生物特點(diǎn)： 繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少方法：方法：表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收感受態(tài)細(xì)胞吸收DNADNA分子分子感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞第29頁/共41頁四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定大腸桿菌大腸桿菌第30頁/共41頁四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定個體水平的鑒定個體水平的鑒定第31頁/共41頁四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定個體水平的鑒定個體水平的鑒定（受體是否表現(xiàn)出相應(yīng)性狀）（受體是否表現(xiàn)出相應(yīng)性狀）第32頁/共41頁 含有目的基因含有目的基因 單鏈單鏈 標(biāo)記標(biāo)記放射性同位素或熒光放射性同位素或熒光第33頁/共41頁第34頁/共41頁第35頁/共41頁第36頁/共41頁第37頁/共41頁 第38頁/共41頁蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物