細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)操作步驟Transwell_第1頁
細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)操作步驟Transwell_第2頁
細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)操作步驟Transwell_第3頁
細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)操作步驟Transwell_第4頁
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文檔簡介

1、遷移實(shí)驗(yàn)(cell migration assay )實(shí)驗(yàn)介紹細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將 Transwell小室放入培養(yǎng)板中,小室內(nèi)稱上室,培養(yǎng)板內(nèi)稱下室,上 下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔,將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi),由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞,應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜,就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。實(shí)驗(yàn)步驟: 1材料準(zhǔn)備: 可拍照顯微鏡,Transwell小室,孔徑8叩,沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常 用),Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板 24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的Transwell

2、小室相配套,BD公司的 Matrigel ,無血清 DMEM , (1%胎牛血清)DMEM 和1640培養(yǎng)基,DMEM 完全培養(yǎng)基,1640完全培養(yǎng)基(也可加到20%血清),無菌PBS,棉簽,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,結(jié)晶紫染液(0.1% (g/ml) PBS結(jié)晶紫)2步驟和流程2.1基質(zhì)膠鋪板:用BD公司的Matrigel 1 : 8 (根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生 mmp的量來決定)稀釋,包被 Transwell小室 底部膜的上室面,置 37 C 30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。2.2制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12 - 24h ,進(jìn)一步去除血清的

3、影響。但這一步并不是必須的。 消化細(xì)胞,終止消化后離心棄去培養(yǎng)液,(用PBS洗1 2遍),用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5X 105/ml。2.3接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液100 l加入Transwell小室。 24孔板下室一般加入600 l含20%FBS的培養(yǎng)基,特別注意的是,下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時(shí)候要特別留心,一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細(xì)胞:常規(guī)培養(yǎng)12 48h (主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定)。24h較常見,時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外,處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響

4、也不可忽視。2.4結(jié)果統(tǒng)計(jì)直接計(jì)數(shù)法,貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù),這里所謂的貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后,可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去,通過給細(xì)胞染色,可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用無鈣的PBS洗2遍,甲醇固定30分鐘,將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞,用 PBS洗3遍。 400倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀察細(xì)胞,記數(shù)。實(shí)驗(yàn)材料(1) Transwell chamber: 24-well, 8.0-m pore membranes (Corning)(2) 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑:無血活培養(yǎng)基,10%血活培養(yǎng)基,PBS 0.02 %

5、 EDTA(3) 固定液:甲醇(4) 染色液:Giemsa染液(5) 封片劑:中性樹膠(6) 其他:小鑲子,棉棒,載玻片,蓋玻片操作步驟(1) 所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和 Transwell chamber 放在37 C溫育;(2) 待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,消化細(xì)胞,用PBSft無血活培養(yǎng)基先后洗滌一次,用無血活培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù),調(diào)整濃度為2X 105 /ml ;(3) 在下室(即24孔板底部)加入600- 800 l含10%血活的培養(yǎng)基,上室加入100150 l細(xì)胞懸液,繼續(xù)在孵箱培養(yǎng) 24小時(shí);(4) 用鑲子小心取出chamber,吸十上室液體,移到預(yù)先加入約 800 l甲醇的 孔中,室溫固

6、定30分鐘;(5) 取出chamber,吸十上室固定液,移到預(yù)先加入約 800 l Giemsa染液的 孔中,室溫染色15-30分鐘;(6) 輕輕用活水沖洗浸泡數(shù)次,取出chamber,吸去上室液體,用濕棉棒小心 擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞;(7) 用小鑲子小心揭下膜,底面朝上晾十,移至載玻片上用中性樹膠封片;(8) 顯微鏡下取9個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)結(jié)果。注意事項(xiàng)(1) 根據(jù)待測(cè)細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-m孔徑(如AGW田胞),如果細(xì)胞體積較大可以考慮用10- 1 m孔徑;(2) 根據(jù)待測(cè)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時(shí)間。常規(guī)24-wellchamber接

7、種細(xì)胞數(shù)約為25X 104/well,遷移時(shí)間1236小時(shí);(3) 由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含12個(gè)獨(dú)立的chamber,為了避免 操作污染,每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊 24孔普通培養(yǎng)板(Corning );(4) 如果細(xì)胞遷移能力較弱,下室液體可用3T3細(xì)胞無血活培養(yǎng)24小時(shí)獲得的 上活加50 g/ml FN (Fibronectin ),具體可查閱相關(guān)文獻(xiàn);(5) 細(xì)胞懸:液加入膜中央,盡量保證液面水平;(6) 固定染色擦洗時(shí)動(dòng)作小心,避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜 表面上未遷移的細(xì)胞,以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑲 子纏上濕棉花擦洗,但要小

8、心避免將膜戳破;(7) Chamber膜上都無法標(biāo)記,操作時(shí)應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組;(8) 充分晾干,避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(cell invasion assay )實(shí)驗(yàn)材料(1) Matrigel (BD 5mg/ml) , -20 C 保存(2) 其余材料同遷移實(shí)驗(yàn)操作步驟(1) Matrigel在4 C過夜融化;(2) 用4C預(yù)冷的無血活培養(yǎng)基稀釋 Matrigel至終濃度1mg/ml,冰上操作;(3) 在chamber±室底部中央垂直加入100 l稀釋后的Matrigel , 37C溫育45小時(shí)使其干成膠狀;(4) 后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)(1-8 )

9、。注意事項(xiàng)(1) Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固,因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提 前在4C預(yù)冷;(2) 鋪膠時(shí)保證液面水平,膠的厚度均勻一致,切勿產(chǎn)生氣泡;(3) 其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn)。其他Transwell做腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)的具體步驟 基質(zhì)膠準(zhǔn)備:將凍存于一80度冰箱的BD matrigel 4度過夜(24h ),變成液態(tài);(2) 取300ul無血清培養(yǎng)基,加入60ul (或50ug/每室)Matrigel ,混勻,(4C操作, 最好在冰浴上),加入上室各100ul (3個(gè)室);放入37C培養(yǎng)箱中,孵育4-5h (>5h); 此間經(jīng)常觀察,當(dāng)出現(xiàn) 白色層”時(shí),說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。

10、注釋:無血清培養(yǎng)基和基質(zhì)膠按1 : 5稀釋,每孔加50ul,在37 C培養(yǎng)箱中1-2h。(3) 消化細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基洗 3次,計(jì)數(shù),配成細(xì)胞懸液;(4) 用無血清培養(yǎng)基洗 Matrigel洗1次;每孔加入100ul細(xì)胞懸液;(5) 下腔室中加入 500ul含有20%FBS條件培養(yǎng)基;(6) 37 C培養(yǎng)箱中,孵育 20-24h ;(7) 取出transwell用PBS洗2遍,5%戊二醛固定,4C;(8) 加入結(jié)晶紫(0.1%)染色或 Giemsa染色(5 10min ),室溫0.5h , PBS洗2遍, 用棉球擦去上表面細(xì)胞,顯微鏡下觀察。遷移實(shí)驗(yàn)transwell在24孔板中浸泡1小時(shí);消

11、化細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基 洗2次,計(jì)數(shù),配成 細(xì) 胞懸液,每孔加入100ul細(xì)胞懸液;加藥刺激;下腔室中加入條件培養(yǎng)基或其他刺激因 子;37C培養(yǎng)箱中,孵育 20-24h ;取出transwell用PBS洗2遍,5% 戊二醛固定, 4C; PBS洗2遍,加入結(jié)晶紫(0.1%)染色,室溫0.5h , PBS洗2遍,用棉球擦 去上表面細(xì)胞,顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)10照相,記錄。侵襲實(shí)驗(yàn)取300ul無血清培養(yǎng)基,加入30ul (或50ug/每室)Matrigel ,混勻,(4 C操 作,最好在冰浴上),加入上室各100ul ( 3個(gè)室);放入37 C培養(yǎng)箱中,孵育4-5h (5h );消化細(xì)胞,無血清培養(yǎng)基洗3次,計(jì)數(shù),配成 細(xì)胞懸液;用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel洗1次;每孔加入 100ul細(xì)胞懸液;下腔室中加入 600ul無血清條 件培養(yǎng)基;37 C 培養(yǎng)箱中,孵育20-24h ;取出transwell用PBS洗2遍,5%戊 二醛固定,4 C ;

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