天然藥物活性篩選中心篩選模型

1、天然藥物活性篩選中心篩選模型抗腫瘤（抗炎）藥物活性篩選 體外腫瘤細(xì)胞毒篩選模型活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTS生成藍(lán)紫色產(chǎn)物，顏色與活細(xì)胞數(shù)目以及細(xì)胞活力成正比。 該方法是細(xì)胞活性檢測的經(jīng)典方法， 廣泛應(yīng) 用于檢測細(xì)胞增殖和抑制、 化合物或者精制組分的體外腫瘤細(xì)胞毒性、 化合物對 受試細(xì)胞的半數(shù)生長抑制濃度 IC50 值的確定、化合物對受試細(xì)胞的抑制效應(yīng)與 劑量相關(guān)性以及化合物對腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞的選擇性毒性測定等。該模型可用于評價化合物對體外腫瘤細(xì)胞生長及增殖的抑制活性，也可用 來指導(dǎo)精制組分中的抗腫瘤活性單體的追蹤分離， 檢測結(jié)果準(zhǔn)確， 重復(fù)性好， 可 高通量進(jìn)行。體內(nèi)抗腫瘤

2、藥效評價模型（裸鼠移植瘤） 采用移植人腫瘤的免疫缺陷小鼠為模型， 對于體外篩選中獲得的具有抗腫瘤 活性的藥物進(jìn)行體內(nèi)活性評價。 該模型廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物研發(fā)， 是抗腫瘤藥 物研發(fā)中的重要環(huán)節(jié)， 結(jié)果綜合反映藥物的體內(nèi)作用效果， 為評價化合物的成藥 性提供重要的數(shù)據(jù)。一氧化氮（NO生成抑制劑篩選一氧化氮（ nitric oxide, NO ）具有廣泛而重要生物學(xué)調(diào)控功能，在炎癥、 腫瘤及心血管系統(tǒng)等均有重要作用。 當(dāng)免疫細(xì)胞遭受微生物內(nèi)毒素、 炎癥介質(zhì)等 刺激時，會生成大量的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶 （ induced NO synthase ， iNOS ）， 生成 NO 進(jìn)行免疫應(yīng)答，因此抑制

3、 NO 生成是化合物抗炎活性的直接指標(biāo)。NO 的含量測定間接反映 iNOS 的表達(dá)水平或酶活性水平， 而編碼 iNOS 的 基因是NF- k B信號通路的直接靶基因，因此該檢測結(jié)果也是評價化合物激活NF- k B信號通路活性的重要指標(biāo)。NF- k B信號通路與腫瘤及其他疾病發(fā)生密 切相關(guān)， 因此該模型檢測結(jié)果對化合物抗腫瘤、 心血管以及神經(jīng)系統(tǒng)等的活性具 有重要的提示作用。該模型直接評價化合物抑制 NO 生成的活性，適合通量篩選，快速，靈敏。 可通過預(yù)刺激確證化合物是否作用于NF- k B信號通路，為進(jìn)一步作用機(jī)制的研究提供線索。NF- k B信號通路抑制劑篩選核轉(zhuǎn)錄因子 NF- k B 通過

4、調(diào)控多種基因的表達(dá)，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、 細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生理過程。細(xì)胞中的NF- k B 與抑制性蛋白 IK B a結(jié)合形成復(fù)合物，并被滯留于細(xì)胞質(zhì)而處于非活化狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到各種 胞內(nèi)外刺激時，I K B a被迅速地降解，NF- K B得以釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控與 細(xì)胞周期和凋亡密切相關(guān)的系列靶基因的表達(dá)。 在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)現(xiàn) NF- k B 信號通路的異常激活，因此該信號通路的抑制劑具有重要的抗腫瘤藥物 成藥前景。該模型應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)直接檢測化合物對NF- k B 信號通路的抑制作用， 方法直接、 靈敏， 檢測結(jié)果是化合物是否作用于信號通路的直接判

5、 斷依據(jù)。wnt 信號通路抑制劑篩選wnt/ B -catenin 信號通路通過調(diào)控細(xì)胞周期，增殖和分化密切相關(guān)的基因（如 cyclin D1, C-Myc 等）表達(dá)，在早期胚胎發(fā)育，成體細(xì)胞增殖以及干細(xì)胞的自 我更新過程中行駛著重要的調(diào)控功能， 該信號通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展 直接相關(guān)， 是重要的抗腫瘤藥物潛在靶點(diǎn)。 規(guī)?；Y選抑制 wnt 信號通路的小分 子化合物是目前國內(nèi)外腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)， wnt 信號通路抑制劑具有重要 的抗腫瘤藥物成藥前景。該模型應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)直接檢測化合物對wnt/ B -catenin信號通路的抑制作用，檢測快速，靈敏度高，可高通量進(jìn)行。

6、蛋白酶體抑制劑篩選模型蛋白酶體是一種高度保守的多價催化蛋白酶復(fù)合物， 廣泛存在于真核細(xì)胞的 核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。這種復(fù)合物能催化水解連接有多聚泛素鏈的蛋白，是泛素 - 蛋 白酶體通路的主要組分，作為體內(nèi)蛋白質(zhì)降解的途徑之一，控制著細(xì)胞的分化、 生長、 凋亡等過程具有非常重要的生理作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)， 抑制蛋 白酶體的功能是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)， 目前已發(fā)現(xiàn)通過抑制蛋白酶體對腫瘤有明 顯療效的藥物，如硼替佐米已批準(zhǔn)用于治療耐藥的多發(fā)性骨髓瘤患。該模型針對蛋白酶體復(fù)合物的核心 20S 催化顆粒進(jìn)行篩選，可直接評價化 合物對蛋白酶體的抑制活性，檢測靶點(diǎn)明確，快速，靈敏度高。I K B激酶-卩(I

7、KK-卩)抑制劑篩選模型NF- k B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與炎癥和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。I k B激酶(IKK)是該信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到胞外信號刺激時，I K B a激酶(IKK)被激活，使I k B aN端絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，并在蛋白酶體的作用下 被識別并降解。從I k B a釋放出來的NF- k B迅速從胞漿轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活 相應(yīng)靶基因表達(dá)，從而調(diào)控炎癥腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展。IKK-卩抑制劑的研究對于抗炎抗腫瘤新藥的開發(fā)具有重要意義，是抗炎抗腫瘤藥物的重要潛在靶點(diǎn)。該模型直接檢測化合物對 IKK-卩激酶的抑制作用，應(yīng)用熒光比色的方法， 檢測靶點(diǎn)明確，快速，靈敏度高。微管

8、蛋白聚合解聚篩選模型微管是細(xì)胞骨架以及細(xì)胞分裂所需細(xì)胞器仿垂體的重要組成成分，處于聚合和解聚的高度動態(tài)平衡狀態(tài)。 在腫瘤細(xì)胞有絲分裂期， 微管參與了染色體的定位、 移動以及分離至兩個子細(xì)胞中， 干擾微管的聚合和解聚， 能夠有效阻斷細(xì)胞分裂 和增殖， 因此是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。 目前臨床使用的抗腫瘤藥物長春花堿， 秋 水仙素以及紫杉醇類藥物均通過該靶點(diǎn)發(fā)揮重要的抗腫瘤作用，因此針對微管篩選新的抗腫瘤藥物具有重要的意義。該模型通過熒光比色直接針對微管蛋白的聚合和解聚過程進(jìn)行檢測，檢測靶點(diǎn)明確，方法快速，靈敏度高。組蛋白去乙?；敢种苿┖Y選模型組蛋白去乙?；?(histone deacetylas

9、e,HDAC) 通過對染色體進(jìn)行結(jié)構(gòu) 修飾在調(diào)控基因表達(dá)過程中發(fā)揮著重要作用。 在細(xì)胞核內(nèi)， 組蛋白乙?；c組蛋 白去乙?；^程處于動態(tài)平衡，并由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HAT )和組蛋白去乙酰化酶共同調(diào)控。 HDAC 使組蛋白去乙?；?，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，在多種 腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn) HDAC 的異常激活從而抑制了抑癌基因的表達(dá)。因此組蛋白 去乙?；敢种苿┦且活愔匾陌邢蚩鼓[瘤藥物。該模型通過熒光比色直接檢測化合物抑制 HDAC 的活性，檢測靶點(diǎn)明確， 方法快速，靈敏度高。神經(jīng)系統(tǒng)藥物活性篩選乙酰/丁酰膽堿酯酶( AChE/ BuChE )抑制活性篩選模型乙 酰膽 堿 (Acetylcholin

10、e, ACh) 是 一種 重要的 神經(jīng) 遞質(zhì)。 乙酰 膽堿 酯酶 (Acetylcholinesterase, AChE ) 是水解乙酰膽堿的特異性膽堿酯酶，丁酰膽堿酯酶 (Butrylcholinesterase, BuChE ) 是膽堿酯酶存在于體內(nèi)的另一種同工酶形式， 是水 解丁酰膽堿的特異性膽堿酯酶。老年癡呆癥(Alzheimer s disease, AD)等神經(jīng)退行性疾病患者腦內(nèi)乙酰膽堿水平低下， 尋找高效的乙酰膽堿酯酶抑制劑是開發(fā)治 療神經(jīng)退行性疾病藥物的基礎(chǔ)。該模型以他克林(膽堿酯酶抑制劑)作為陽性對照，化合物與乙酰/ 丁酰膽堿酯酶的混合液在 30 C反應(yīng)，乙酰/丁酰膽堿酯酶能

11、夠催化其底物類似物碘化硫 代乙酰 /丁酰膽堿降解，生成硫代膽堿和乙酸/丁酸，反應(yīng)生成物與顯色劑DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，在 405nm 處有特異光吸收。如果化合物對乙酰/丁酰膽堿酯酶有抑制作用，那么乙酰 /丁酰膽堿酯酶催化底物類似物碘化硫代乙酰 /丁酰膽堿 降解的量就會減少，相應(yīng)的與 DTNB 反應(yīng)生成的黃色化合物減少，即在 405nm 處的光吸收值變小，以此來篩選具有抑制活性的化合物。促進(jìn) PC12 細(xì)胞分化活性篩選模型神經(jīng)生長因子（ nerve growth factor ，NGF ）是最早發(fā)現(xiàn)的能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞 存活、 生長和分化的神經(jīng)營養(yǎng)因子， 已經(jīng)開發(fā)應(yīng)用于外周感覺性神經(jīng)病、 早老性

12、 癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床試驗(yàn)。 然而， NGF 的某些蛋白質(zhì)性質(zhì) （如化學(xué)性質(zhì)不 穩(wěn)定、半衰期短、藥代動力學(xué)特性欠佳、不易通過血腦屏障等）限制了其成為理 想的臨床用藥。因此，尋找小分子 NGF 類似物成為神經(jīng)系統(tǒng)藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。該模型以未分化的PC12細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，采用包被培養(yǎng)方式，以 NGF為陽 性對照，化合物溶媒作為對照組，誘導(dǎo) 72h后，顯微鏡下觀察并記錄 PC12細(xì)胞分 化情況，統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞分化率（軸索長度老田胞直徑的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)）、具有軸索的 細(xì)胞數(shù)、 細(xì)胞平均軸索數(shù)、梭形細(xì)胞比例等細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)參數(shù)，以此篩選出具有促進(jìn)PC12細(xì)胞分化活性的化合物。鈣流活性篩選模型鈣（Ca）是人

13、體內(nèi)重要的必需元素之一，生物體內(nèi)幾乎所有的生理活動都 受鈣離子（Ca2+）調(diào)控。鈣離子作為第二信使把外源信號轉(zhuǎn)變成胞內(nèi)信號，導(dǎo)致 一系列胞內(nèi)事件及生理反應(yīng)的發(fā)生，如基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、肌肉收縮等。研究 表明Ca2+的信使功能是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度來實(shí)現(xiàn)的。該模型以細(xì)胞為檢測對象，使用離子指示劑 Fluo 4-AM作為細(xì)胞內(nèi)Ca2+的測 定技術(shù)。 Fluo 4-AM 是 Fluo 4 的一種乙酰甲酯衍生物（ AM ），通過培養(yǎng)，能夠輕 易進(jìn)入細(xì)胞中。 AM 進(jìn)入細(xì)胞后會被胞內(nèi)酯酶所水解， 產(chǎn)生 Fluo 4，未結(jié)合的 Fluo 2+4熒光很弱，與游離的鈣離子 （Ca ）結(jié)合后產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。

14、使用 Thermo Scientific 高內(nèi)涵藥物篩選儀，激發(fā)光 485nm， 5s檢測一次，持續(xù)檢測 5min，以熒光的變 化來判定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化， 從而評價化合物的鈣流活性， 為下一步的作 用機(jī)制研究提供線索。線蟲長壽模型 I即線蟲daf-16轉(zhuǎn)位入核藥物篩選。 daf-16位于Insulin-like生長因子（IGF）信號通路下游，該信號通路調(diào)節(jié)線蟲的發(fā)育、生長、體長、繁殖及繁殖率、代謝以及 行為等。 作為神經(jīng)內(nèi)分泌信號通路之一，該通路也調(diào)節(jié)線蟲壓力的耐受性。 以這 個信號通路為靶標(biāo)的化合物可能對線蟲抗衰老甚至抗神經(jīng)退行性疾病會有顯著 作用。該模型以 TJ356 線蟲株為實(shí)驗(yàn)對

15、象， TJ356 是 daf-16:GFP 轉(zhuǎn)基因線蟲株， 正常情況下， daf-16 分布在胞質(zhì)，當(dāng)化合物作用于 Insulin-like 生長因子( IGF ) 信號通路時， daf-16 轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)控一系列基因的表達(dá)，在熒光顯微鏡下可見核內(nèi) 聚集熒光，由此可以確定化合物是否對于該信號通路有作用。線蟲長壽模型 II即線蟲壽命( Lifespan )藥物篩選。衰老指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后， 隨年齡增加，自身機(jī)能減退，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降，結(jié)構(gòu)、組分逐步 退行性變化，趨向死亡的不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。衰老是一種漸變的、泛化的、全身性 的功能衰退， 從而導(dǎo)致生物體對環(huán)境的耐受性降低和疾病以及

16、死亡的發(fā)生。 生物 體的這種衰老是可以通過改變生物體之間保守的信號通路、 基因或者通過給藥得 到延緩， 并且衰老的延遲往往推遲了相關(guān)疾病的發(fā)生。 尋找抗衰老活性的化合物 是延緩衰老甚至延遲相關(guān)疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。該模型以 N2 線蟲株為實(shí)驗(yàn)對象， 通過固體培養(yǎng)方式， 采用 FUDR 平板表面 給藥的方式， 以不作任何處理的 FUDR 平板作為對照， 挑入 L4 后期 N2 株線蟲， 20 C培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)兩種平板培養(yǎng)方法下N2株線蟲的壽命，能延長N2株線蟲壽命的化合物，可能具有抗衰老活性。抗腦缺血藥藥效檢測中風(fēng)(stroke)是繼心臟病和癌癥后的第三大致死疾病，早已成為醫(yī)藥界關(guān) 注的焦點(diǎn)。中風(fēng)分為 2

17、 種類型： 缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)。 其中缺血性中風(fēng)大約 為中風(fēng)總數(shù)的 87 ，已經(jīng)成為大多數(shù)治療中風(fēng)藥物的研究對象。了解候選藥物 對缺血造成的腦部損傷是否具有預(yù)防和改善作用是篩選出治療中風(fēng)藥物的關(guān)鍵。大鼠腦中動脈阻塞( MCAO ， Middle Cerebral Artery Occlusion )是通過手 術(shù)栓塞大鼠大腦的腦中動脈， 造成大鼠單側(cè)大腦半球缺血， 模擬缺血型中風(fēng)。 缺 血 2 小時后拔出栓線實(shí)現(xiàn)再灌注。 此手術(shù)后， 大鼠會表現(xiàn)出較為一致的行為障礙，取出腦組織經(jīng) 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（ TTC ）溶液染色后可以看到較為一致的 缺血區(qū)域， 能夠較好的模擬中風(fēng)后對腦組織造

18、成的損傷。 該模型是目前國際上最 為通行的腦缺血模型之一。候選藥物配制成注射液，在大鼠再灌注后經(jīng)注射給藥。在給藥 24 小時和 48 小時檢測大鼠行為， 48 小時行為檢測后快速取腦切片染色并計(jì)算缺血面積。 與模型組相比，如果注射了候選藥物的大鼠在行為評分或腦缺血面積上有所改 善，則說明該候選藥物可能對中風(fēng)具有潛在的療效。 這是目前篩選治療中風(fēng)藥物 較為通用，也是較為可靠的方法?？估夏臧V呆藥藥效檢測乙酰膽堿 （A） 是）是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)。乙酰膽堿酯酶（AChE ）是水解乙酰膽堿的特異性膽堿酯酶， 老年癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病患者腦內(nèi)乙酰膽堿水平 低下。老年斑是老年癡呆癥 （AD） 的主要標(biāo)志

19、之一，其主要成分是由淀粉樣前體 蛋白（APP）衍生的 伊淀粉樣多肽（A卩）Morris水迷宮是檢測模式動物學(xué)習(xí)記憶能 力的常用手段。本模型用雙轉(zhuǎn)基因癡呆癥模型小鼠（ PrP-hApp/hPS1 雙轉(zhuǎn)基因 AD 小鼠）進(jìn) 行候選藥物活性檢測。該 AD 小鼠在 3 月齡出現(xiàn)認(rèn)知行為學(xué)變化， 5 月齡出現(xiàn)老 年斑， 12 月齡有大量老年斑形成。通過觀察給藥后 AD 小鼠在 Morris 水迷宮實(shí) 驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶能力，小鼠腦部 AChE活性和A卩含量來檢測和評價候選藥物抗 老年癡呆能力，為候選藥物的進(jìn)一步臨床研究提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？拱d癇藥藥效檢測戊四氮能直接興奮呼吸中樞及血管運(yùn)動中樞，使呼吸增加、

20、血壓微升?？捎?于急性傳染病、 麻醉藥及巴比妥類藥物中毒時引起的呼吸抑制， 是一種神經(jīng)興奮 性藥物。因此可皮下注射戊四氮誘發(fā)小鼠痙攣來模擬癲癇癥狀。本模型用生理鹽水作為空白對照組，乙琥胺、丙戊酸鈉及苯妥因鈉作為陽性藥對照組，采用給小鼠腹腔注射受試候選藥物，30 分鐘后皮下注射戊四氮，然后以 “首次延遲 5 秒的 5 級癲癇發(fā)作時間、延遲 5 秒的 5 級癲癇發(fā)作次數(shù)及死 亡情況 ”三個指標(biāo)初步評判受試化合物的抗癲癇藥效，為候選藥物的進(jìn)一步臨床 研究提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？挂钟羲幩幮z測模型抑郁癥是一種常見的精神疾病，臨床主要表現(xiàn)為情緒低落，思維遲緩以及 運(yùn)動抑制，嚴(yán)重者可出現(xiàn)自殺念頭和行為。 受

21、社會競爭加劇和老齡化的影響， 我 國抑郁癥的發(fā)病率已呈現(xiàn)出上升趨勢。當(dāng)前我國抑郁癥的患病率為3-5% ，抑郁癥者已超過 2600 多萬人，抑郁癥已成為一個不容忽視的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。強(qiáng)迫游泳和懸尾是最常用的行為絕望模型，它們被廣泛的應(yīng)用于抗抑郁作 用的篩選，抑郁癥發(fā)病和治療機(jī)制的研究。它們具有簡單、快速、敏感等特點(diǎn)， 常用于抗抑郁藥物的快速篩選。本模型用 C57BL/6J 小鼠作為研究對象，檢測候選藥物對小鼠在強(qiáng)迫游泳 和懸尾情形下的行為反應(yīng)。使實(shí)驗(yàn)小鼠在強(qiáng)迫游泳或懸尾的應(yīng)激狀態(tài)下持續(xù) 6 分鐘， 通過視頻軟件分析、 比較后 4 分鐘的不動時間來評價候選藥物的抗抑郁能 力，為候選藥物的進(jìn)一步

22、臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。心血管系統(tǒng)藥物活性篩選體外血液學(xué)活性篩選模型活化部分凝血活酶時間（ APTT ）、凝血三項(xiàng)包括凝血酶原時間（PT）和凝血酶時間（TT ）是化合物或候選藥物體外抗凝活性的重要檢測指標(biāo)。APTT主要用來檢測化合物或候選藥物對內(nèi)源性凝血的影響， PT 主要檢測化合物或候選藥 物對外源性凝血的影響， TT 則是用來判斷化合物或候選藥物對共同凝血途徑的 影響。 該藥效學(xué)模型采用人質(zhì)控血漿試劑盒法進(jìn)行凝血三項(xiàng)測試， 能夠篩選抗凝 血活性化合物。血液凝固是一系列凝血因子相互激活形成酶促級聯(lián)反應(yīng)凝血瀑布”的過程。血漿中有12種凝血因子，這些凝血因子是血液凝固的物質(zhì)基礎(chǔ)。純因子系 統(tǒng)條件下

23、，研究抗凝血化合物或候選藥物對這些凝血因子的活性影響，可以找出化合物或候選藥物的凝血作用機(jī)制和作用靶蛋白。本模型采用純?nèi)司壞蜃酉到y(tǒng)，酶學(xué)生色底物反應(yīng)法測定化合物對凝血因子的影響，以確認(rèn)化合物的抗凝血作用機(jī)制，目前主要包括：AT-III依賴的抗凝血因子 Ila和Xa活性；HCII依賴的抗凝血因子Ila活性，抗凝血因子 Xase酶活性，激活凝血因子 XII活性。治療糖尿病/代謝性疾病藥物活性篩選胰島素增敏活性篩選模型胰島素（Insulin ）作用于肌肉和脂肪細(xì)胞后激活其信號通路，從而調(diào)動葡 萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 4 （GLUT4從胞內(nèi)向胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而完成葡萄糖攝取。不同的胰島 素刺激濃度和GLUT4在胞

24、膜上的表達(dá)量呈線性關(guān)系，故而檢測GLUT4的膜轉(zhuǎn)運(yùn)率 即為檢測胰島素敏感性的指標(biāo)。該模型采用過表達(dá)GLUT4的脂肪細(xì)胞作為檢測模型，量化化合物處理后GLUT4在細(xì)胞膜上的分布量。利用NIKONTi-E熒光顯微鏡和 Metamorph Offline軟件實(shí)現(xiàn)對圖像的全自動采集和數(shù)據(jù)分析。根據(jù)化合物的作用時間不同，該模型可以分為急性或慢性檢測。此外，該模型具有靈敏性高、作用靶點(diǎn)明確等特點(diǎn)，是適合初步批量篩選胰島素增敏活性的有效模型。葡萄糖重吸收抑制活性篩選模型SGLT2全稱為2型鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體，其生理功能是在腎臟近曲小管完成對原尿中約90%的葡萄糖重吸收。SGLT2抑制劑能夠抑制腎臟對葡萄糖的

25、重吸收, 通過增加尿糖排泄的方式降低機(jī)體血糖。 同時， 它不依賴于內(nèi)源性胰島素而發(fā)揮 作用，降低血糖的同時能降低體重，是治療糖尿病藥物篩選中的一個新靶點(diǎn)。該模型利用帶發(fā)光基團(tuán)的葡萄糖類似物 2-NBDG 作為指示劑(綠色發(fā)光) ， 檢測永生化的人腎近曲小管上皮細(xì)胞 HK-2 細(xì)胞的葡萄糖攝取情況。因此，該模 型對被測化合物抑制 SGLT2的活性具有提示作用。適合靈敏、批量，快速地初步篩選有抑制活性的化合物。 根據(jù)化合物作用時間的不同， 該模型可以檢測化合物 的急性或是慢性抑制活性。減肥活性篩選模型在正常情形下， 脂肪細(xì)胞數(shù)目到了青春期后就不再增加。 成年以后發(fā)胖的人， 一般是脂肪細(xì)胞因儲藏過多

26、脂肪而變大所造成。 在人體內(nèi)， 脂肪是以甘油三酯的 形式儲存在脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂滴中。油紅O(Oil Red 0)是一種易溶于甘油三酯的染料，可以通過Oil Red O染色方法來判斷脂肪細(xì)胞中脂肪的積聚水平。該模型采用分化成熟后的3T3-L1 脂肪細(xì)胞作為檢測模型，用 Oil Red O染色法來檢測脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量，從而 判斷化合物是否具有脂解作用，進(jìn)而篩選出有減肥活性的化合物。該方法靈敏、 簡便、適合批量篩選。抗胰島素抵抗活性篩選模型胰島素抵抗(in sulin resista nee, IR)是胰島素發(fā)揮作用的靶器官組織(如脂肪 和肌肉細(xì)胞) 對一定劑量胰島素所產(chǎn)生的生理效應(yīng)低于正常水

27、平的一種狀態(tài)，是2 型糖尿病主要發(fā)病原因。該模型根據(jù) 2 型糖尿病中機(jī)體在維持較高胰島素濃度的條件下仍然不能有效 發(fā)揮其生理效應(yīng)的特點(diǎn)， 用高濃度胰島素孵育脂肪細(xì)胞， 引起其產(chǎn)生胰島素抵抗。 即在相同濃度的胰島素刺激下， 與正常細(xì)胞相比， 產(chǎn)生胰島素抵抗的細(xì)胞只能調(diào) 動部分葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 4 ( GLUT4)上膜，不能有效完成葡萄糖攝取的功能。利用該模型可直接評價化合物抗胰島素抵抗的活性。根據(jù)化合物對細(xì)胞的作 用時間不同，還可以分為急性或慢性檢測。該模型靈敏、靶點(diǎn)準(zhǔn)確，適合批量篩選。皮膚化妝品活性篩選B16、HDFa細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)通過 MTS 比色法，確定樣品的 CC50 (50% cytotoxic concentration)，即對 50% 的細(xì)胞產(chǎn)生毒性時的藥物濃度，從而確定以下活性實(shí)驗(yàn)的安全樣品濃度。細(xì)胞與樣品共同孵育后，加入MTS試劑，MTS是一種新合成的四唑類化合物，能夠被活細(xì)胞線粒體中的多種脫氫酶還原成水溶性甲瓚產(chǎn)物，其顏色深淺與活細(xì)胞數(shù)在一定范圍內(nèi)呈高度相關(guān)，通過酶標(biāo)儀測定其490nm下的吸光值以確定細(xì)胞的存活率。與MTT方法比較，MTS比色法更加靈敏簡便，快速安全。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)當(dāng)自由基超過人體的抗氧化防御能力時，受損的分子和