師范學(xué)院畢業(yè)論文 (設(shè)計(jì))

1、.漳州師范學(xué)院畢業(yè)論文 (設(shè)計(jì))多吡啶銅配合物在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用multi-copper complex Application in Electrochemical Sensor朗讀顯示對(duì)應(yīng)的拉丁字符的拼音 字典可翻譯 50 多種語(yǔ)言· miracoloso· · · Je parle un petit peu français.· hoje está ensolarado· escargots· Es ist sehr interessant!· Buongiorno Prin

2、cipessa!· Ich bin vierzig Jahre alt· · · dti· Je ne sais pas !· nazdar!· ! · · hello· rouge· ¿Cómo estás?· .· · La voiture· · mijn vriend· haydi gidelim· · Wie bitte?· · · Wie

3、 heißen Sie?· Vær så snill· Wie gehts?· Pardon ?· s t· · Hjelp! 姓名 吳星星 學(xué)號(hào) 070601103 系別 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系 專業(yè) 化學(xué) 教 育 年級(jí) 07級(jí) 指導(dǎo)老師 倪建聰 2011年5月摘要 轉(zhuǎn)基因植物(GMP)是基因工程技術(shù)的快速發(fā)展的產(chǎn)物，在其造福人類的同時(shí)，也帶來(lái)了安全性問(wèn)題和潛在的環(huán)境危害。因此加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品準(zhǔn)確和快速檢測(cè)以達(dá)到安全性評(píng)估顯得尤為重要，DNA 電化學(xué)傳感器為這種檢測(cè)提供了可能。DNA 電化學(xué)傳感技術(shù)具有簡(jiǎn)

4、單、可靠、價(jià)廉、靈敏和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。金屬配合物作為雜交指示劑具有合成簡(jiǎn)單、種類繁多、光電信號(hào)靈敏和可控功能修飾等優(yōu)點(diǎn)，已在電化學(xué)生物傳感器研究中被廣泛使用。在本文中，我們采用電化學(xué)法詳細(xì)研究了這些配合物與單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA（dsDNA）的識(shí)別作用。通過(guò)電化學(xué)生物傳感器，將轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的基因探針固定在電極表面，并選用對(duì)ssDNA 和 dsDNA具有識(shí)別功能的金屬配合物作為雜交指示劑對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行了檢測(cè)。ABSTRACTGenetically modified plants (GMP) are the product of the rapid developing genet

5、ic engineering. While bringing benefit for mankind, it also brings security issues and potential environmental hazards. Therefore, in order to achieve safety assessment ，strengthening accurate and rapid detection of transgenic plant products is , and DNA electrochemical sensor provides the testing p

6、ossibility. DNA electrochemical sensor technology is of simple, reliable, cheap, well sensitivity and selectivity. As hybridization indicators, metal complexes have simply synthesizing, variety, sensitivity photoelectric signal, and controlled features modification, etc. and has been widely used in

7、biosensor research.In this paper, we studied the recognition effect between these complexes and single-stranded DNA (ssDNA) and double-stranded DNA (dsDNA) in detail by electrochemical method. Through the biosensor , gene probe of the transgenic plant products was fixed on the electrode surface, and

8、 the metal complexes recognizing ssDNA and dsDNA were used as hybridization indicators for detecting the target sequences關(guān)鍵詞 過(guò)渡金屬配合物 DNA 探針 電化學(xué)傳感器 玻碳電極 雜交指示劑目 錄中文摘要英文摘要1 前言2 實(shí)驗(yàn)部分2.1試劑和儀器2.2 Cu(Phen)(PC)(H2O) 與dsDNA 相互作用的電化學(xué)研究2.2.1 玻碳電極的預(yù)處理2.2.2 吸附法制備DNA修飾玻碳電極2.2.3 Cu(Phen)(PC)(H2O) 與 dsDNA 和 ssDNA 在

9、電極表面的相互作用2.3 Cu(Phen)(PC)(H2O) 作為雜交指示劑檢測(cè)CaMV35S的研究2.3.1 S1 探針在玻碳電極上的固定及與S2 的雜交2.3.2 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的富集及電化學(xué)檢測(cè)3 結(jié)果與討論3.1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 與 ssDNA 和 dsDNA 在電極表面的相互作用3.1.1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 與 ssDNA 和 dsDNA 的不同結(jié)合屬性研究3.1.2掃描速率影響3.1.3 富集時(shí)間影響3.1.4 Cu(Phen)(PC)(H2O) 從DNA修飾電極上的解離動(dòng)力學(xué)研究3.2 GCE修飾電極電化學(xué)表征3.3 基

10、因靶序列的定量檢測(cè)3.4 傳感器的選擇性4 小結(jié)參考文獻(xiàn)附錄致謝1 前言電化學(xué)DNA生物傳感器是上世紀(jì)九十年代發(fā)展起來(lái)的一種全新的基因檢測(cè)技術(shù)，屬于功能性生物傳感器的一種1。其通常由一個(gè)支持ssDNA片段(探針)電極和檢測(cè)用的電化學(xué)活性雜交指示劑構(gòu)成，檢測(cè)原理如圖1所示。由于ssDNA與其互補(bǔ)靶序列雜交具有高度的特異選擇性，使得這種 ssDNA 修飾電極呈現(xiàn)極強(qiáng)的分子識(shí)別功能。在適當(dāng)?shù)臏囟?、酸堿度和離子強(qiáng)度條件下，電極表面的DNA探針鏈與靶序列發(fā)生雜交反應(yīng)，形成 dsDNA ，從而導(dǎo)致電極表面結(jié)構(gòu)的變化。因?yàn)殡s交后形成的 dsDNA 在電極表面上的電化學(xué)信號(hào)較差，因此選擇一種能夠區(qū)分 dsDN

11、A 和 ssDNA 結(jié)構(gòu)差異的電活性指示劑能夠大大提高檢測(cè)雜交過(guò)程的靈敏度。圖1 電化學(xué)DNA雜交傳感器的工作原理1 Figure 1 The principle of an electrochemical DNA hybridization biosensor1與目前常用的基因檢測(cè)方法，如光譜法2-3，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法4-7和放射性同位素標(biāo)記法8-9等相比，電化學(xué)檢測(cè)在快速、靈敏、簡(jiǎn)便、無(wú)毒、低成本和活體檢測(cè)應(yīng)用等方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)10-13。電化學(xué)雜交指示劑是DNA雜交電化學(xué)傳感器的重要組成元件，能為雜交過(guò)程提供可測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。因配合物具有許多光學(xué)、電學(xué)優(yōu)良特性，目前作為一

12、類對(duì) ssDNA 和 dsDNA 具有識(shí)別能力的小分子也越來(lái)越受到重視，另外因?yàn)榻饘倥浜衔锓N類多且可根據(jù)需要對(duì)配合物的配體和中心離子進(jìn)行簡(jiǎn)單、可控的修飾和變換都位配合物在優(yōu)秀雜交指示劑上的應(yīng)用具有廣闊的前景。 1994年，首例轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品-耐貯存番茄進(jìn)入市場(chǎng)，1996 年后轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)業(yè)化迅速發(fā)展，勢(shì)不可擋。至 2005 年在全球 21 個(gè)國(guó)家轉(zhuǎn)基因植物推廣應(yīng)用總面積達(dá)到9000 萬(wàn)公頃， 1996 年至 2005 年十年間全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積增長(zhǎng)近 53 倍，累計(jì)種植面積已達(dá) 4.746 億公頃(合 71.19 億畝)，相當(dāng)于我國(guó)耕地面積的 3.75倍。所謂轉(zhuǎn)基因植物，就是將人工分離和

13、修飾過(guò)的外源基因?qū)氲叫枰牧嫉纳矬w的基因組中，使之產(chǎn)生新的性狀，如抗蟲(chóng)、抗病、抗旱、抗寒、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等，從而達(dá)到改造生物的目的。轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)質(zhì)上是傳統(tǒng)育種方法的延伸，其本質(zhì)與傳統(tǒng)常規(guī)雜交育種相同。傳統(tǒng)的常規(guī)育種一次轉(zhuǎn)移的是成千上萬(wàn)個(gè)不同植物品種甚至不同植物種類的基因；而基因工程只是轉(zhuǎn)移一個(gè)或數(shù)個(gè)基因，且更為準(zhǔn)確、更具預(yù)見(jiàn)性和高效率。 2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 試劑和儀器 天然雙鏈鯡魚(yú)精子 DNA(dsDNA) 購(gòu)自北京精科試劑公司，使用前未做進(jìn)一步處理。天然DNA儲(chǔ)備液的配制及濃度確定為1 g/ L。所有電化學(xué)和光譜實(shí)驗(yàn)均在0.02 mol/L pH 5.0 BR 緩沖溶液中進(jìn)行。乙基-(3-二

14、甲基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購(gòu)自上海延長(zhǎng)生化科技有限公司。二次蒸餾水用于所用溶液的配制。 電化學(xué)方法在 CHI 650D 電化學(xué)工作站(上海辰華)上進(jìn)行，采用三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極(=3 mm)，參比電極為 Ag/AgCl 電極，輔助電極為鉑絲電極。2.2 Cu(Phen)(PC)(H2O)與dsDNA相互作用的電化學(xué)研究2.2.1 玻碳電極的預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)前，將玻碳電極依次采用1.0 m、0.3 m和0.05 m的 -Al2O3 拋光粉打磨成鏡面，然后用丙酮、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水依次超聲處理。2.2.2 吸附法制備DNA修飾玻碳電極 滴加10 L 0

15、.1 g/L dsDNA 于處理后的裸玻碳電極表面，在室溫下過(guò)夜風(fēng)干，然后用二次蒸餾水淋洗去除未吸附的 dsDNA，就得到 dsDNA 修飾電極(dsDNA/GCE)。采用相同方法，將 dsDNA 替換為 ssDNA ，即可制備得到 ssDNA 修飾電極 (ssDNA/GCE) 。2.2.3 Cu(Phen)(PC)(H2O) 與 dsDNA 和 ssDNA 在電極表面的相互作用配合物與 dsDNA 和 ssDNA 在電極表面的相互作用通過(guò)將 dsDNA/GCE或 ssDNA/GCE 放入含 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的0.02 mol/L pH 5 BR 緩沖溶液中開(kāi)路富集10 m

16、in富集達(dá)到平衡，然后進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定。配合物在 dsDNA/GCE 和ssDNA/GCE 上的解離實(shí)驗(yàn)通過(guò)將飽和富集了 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的修飾電極用二次蒸餾水淋洗后迅速放入0.02 mol/L pH 5 BR 緩沖溶液中隔一定時(shí)間進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定得到。2.3Cu(Phen)(PC)(H2O) 作為雜交指示劑檢測(cè)CaMV35S的研究2.3.1 S1 探針在玻碳電極上的固定及與S2 的雜交將預(yù)處理后的玻碳電極放入0.02 mol/L BR 緩沖溶液中在+1.7 V 極化180 s，取出用二次蒸餾水淋洗，得到氧化修飾電極 GCE 。將處理后的電極放在 20l EDC+NHS 混合

17、液中浸泡 20 min 取出，取10 L 10-7 g/L 的S1 探針滴涂于上述處理后的電極表面，自然晾干后再用 PBS 緩沖溶液洗滌30 s，即得到探針修飾電極S1/GCE。2.3.2 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的富集及電化學(xué)檢測(cè) 取10 L含1.0×10-13 mol/L互補(bǔ)序列S2 的雜交液于上述探針修飾電極S1/GCE上在42 ºC下反應(yīng)0.5 h 后用二次水淋洗30 s ，放入含8×10-5 mol/L Cu(Phen)(PC)(H2O) 的 BR 緩沖溶液中富集10 min后取出淋洗，然后在0.02 mol/L pH 5 的 BR 緩沖溶液

18、中進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定。3 結(jié)果與討論3.1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 與 ssDNA 和 dsDNA 在電極表面的相互作用3.1.1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 與 ssDNA 和 dsDNA 的不同結(jié)合屬性研究 我們將 ssDNA 和 dsDNA 通過(guò)吸附法固定在電極表面，然后研究了 ssDNA 和 dsDNA 與 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在電極表面的相互作用機(jī)理和結(jié)合參數(shù)。圖2為 4.59×10-4 mol/L Cu(Phen)(PC)(H2O) 分別在裸 GCE ，ssDNA/GCE 和 dsDNA/GCE 上得到的循環(huán)伏安圖。在各個(gè)電極上得到的電化學(xué)

19、數(shù)據(jù)列于了表1。由圖2中的曲線 a 和 b 及表1 上的數(shù)據(jù)可以看出，dsDNA/GCE 上得到的氧化還原峰電流較 GCE 上都有了明顯的增大，表明修飾電極上的 dsDNA 對(duì)電活性的 Cu(Phen)(PC)(H2O) 產(chǎn)生了富集作用。另外， 配合物在 dsDNA/GCE 上的式電位 E0 較裸電極上也出現(xiàn)了明顯的正向移動(dòng)，表明配合物與 dsDNA 在電極表面同樣存在著嵌插作用14。而配合物在 dsDNA/GCE 上的峰電位差與其在裸電極上相比有了明顯的增大，表明配合物在修飾電極表面電化學(xué)過(guò)程的不可逆性增強(qiáng)，這可能是因?yàn)榕浜衔锴恫暹M(jìn)入 dsDNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)中的堿基對(duì)以后，配合物的電活性中心

20、被 dsDNA 包圍所引起的。abIp/10-6Ac E/V圖2 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在裸電極(a),ssDNA/GCE(b) 和 dsDNA/GCE(c)上的循環(huán)伏安圖Figure 2 CVs of Cu(Phen)(PC)(H2O) at the bare GCE (a), ssDNA/GCE (b) and dsDNA/GCE(c)8×10-5mol/L Cu(Phen)(PC)(H2O) + 0.02 mol/L pH 5 BR;Accumulation time, 5 min; Scan rate, 0.10 V/s.配合物在 ssDNA/GCE 上得到的電

21、化學(xué)響應(yīng)顯示峰電流較裸電極相比有所增大，而與 dsDNA/GCE 相比則要小得多，表明了 ssDNA 和 dsDNA 在電極表面對(duì) Cu(Phen)(PC)(H2O) 具有不同的親和富集能力。配合物在 ssDNA/GCE 上式電位的負(fù)移表明二者的主要結(jié)合模式為靜電作用。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，配合物與 ssDNA 和 dsDNA 具有不同的結(jié)合模式，配合物可以作為一種有效的電化學(xué) DNA 金屬嵌插劑用于 ssDNA 和 dsDNA 的識(shí)別。表1 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在不同電極上的電化學(xué)數(shù)據(jù)Table 1 Electrochemical data of Cu(Phen)(PC

22、)(H2O) at different electrodesElectrodes Epc/mV Epa/mV Ep/mV Ipc/uA Ipa/uAGCE -72 9 63 1.47 -1.47ssDNA/GCE 80 -0.04 79.96 1.36 -1.40dsDNA/GCE 21 102 81 1.69 -1.20 3.1.2掃描速率影響溶液實(shí)驗(yàn)方法已經(jīng)驗(yàn)證無(wú)論 DNA 是否存在于 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中，配合物在裸玻碳電極表面的電化學(xué)行為均受擴(kuò)散過(guò)程控制。我們?cè)谙嗤臈l件下考察了掃速 v 對(duì)配合物在 ssDNA 和 dsDNA 修飾電極上峰電流的影響。結(jié)果如圖3所

23、示，在 dsDNA/GCE上，氧化還原峰電流 Ipa與掃速 v 呈良好的線性關(guān)系，而與掃速平方根v1/2 呈彎曲關(guān)系，這表明 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在修飾電極表面的電化學(xué)行為已轉(zhuǎn)換成了受吸附控制過(guò)程15，即電極表面的 dsDNA 對(duì) Cu(Phen)(PC)(H2O) 產(chǎn)生了富集作用。abIpa/10-7Av/(V/s) or v1/2/(V/s)1/2圖3 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在8.0×10-5 g/L dsDNA/GCE 上氧化峰電流 Ipa 與掃速v或掃速平方根 v1/2 的關(guān)系曲線Figure 3 Relationships of oxidati

24、ve peak currents I pa of Cu(Phen)(PC)(H2O) at the dsDNA/GCE and the scan rate v or square root of scan rate v 1/2 a. dsDNA/GCE, I pa v ; b. dsDNA/GCE, I pa v 1/2 Other conditions are the same as Figure 53.1.3 富集時(shí)間影響通過(guò)連續(xù)多次掃描和間隔一定時(shí)間掃描進(jìn)一步考察了 dsDNA/GCE 和ssDNA/GCE 對(duì)配合物 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的富集作用。圖4為裸 GCE，ss

25、DNA/GCE 和 dsDNA/GCE 浸入 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中進(jìn)行連續(xù)多掃的循環(huán)伏安圖。在 GCE 上能得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線(圖4 A )，表明該電極對(duì)配合物沒(méi)有吸附效應(yīng)，與配合物之間只有簡(jiǎn)單的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，電極表面的狀態(tài)不隨掃描次數(shù)的增加而變化。而對(duì)于ssDNA/GCE 和 dsDNA/GCE，隨著掃描次數(shù)的增加，配合物的氧化還原峰電流均有增大的趨勢(shì)(圖4 B 和 C )，均表明兩種電極對(duì)配合物具有富集作用，只是在 ssDNA/GCE 上，幾次掃描之后就可達(dá)到穩(wěn)定，而在 dsDNA/GCE 上達(dá)到穩(wěn)定伏安曲線需要更多的掃描次數(shù)，且也有更大的電流增大幅度。 當(dāng)將 d

26、sDNA/GCE 和 ssDNA/GCE 浸入配合物溶液中富集一定時(shí)間進(jìn)行伏安掃描時(shí)，在開(kāi)始階段，均隨著富集時(shí)間的增加，氧化電流出現(xiàn)顯著增大，而當(dāng)ssDNA/GCE 富集1 min 后，得到最大峰電流，然后趨于穩(wěn)定；對(duì)于 dsDNA/GCE達(dá)到飽和富集電流則需要7 min。上述兩個(gè)富集實(shí)驗(yàn)均表明電極上的 ssDNA 和 dsDNA 對(duì)配合物均產(chǎn)生了富集作用，而 ssDNA 則較 dsDNA 能在更短的時(shí)間內(nèi)與 Cu(Phen)(PC)(H2O) 作用完全，這驗(yàn)證了 dsDNA 和 ssDNA 與配合物之間的不同作用模式：配合物與 dsDNA 主要通過(guò)疏水性的嵌插作用結(jié)合，而與 ssDNA 則通

27、過(guò)靜電模式結(jié)合，作用主要發(fā)生在 dsDNA 的外部，易于作用完全。同時(shí)，配合物能通過(guò) dsDNA 內(nèi)部堿基對(duì)的電子傳遞屬性在電子表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，因此能獲得更為靈敏的電化學(xué)信號(hào)16。I/10-6AAE/VBI/10-6A E/VCI/10-6ASweep times E/V圖4 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在 GCE(A), ssDNA/GCE(B) 和 dsDNA/GCE(C) 上的多掃循環(huán)伏安圖Figure 4 Muti-sweep CVs of Cu(Phen)(PC)(H2O) at GCE (A), ssDNA/GCE (B) anddsDNA/GCE (C)Arrow in

28、 (C) shows the increasing process of peak currents accompanied with the increase of sweep times. Other conditions are the same as Figure 5.3.1.4 Cu(Phen)(PC)(H2O) 從DNA修飾電極上的解離動(dòng)力學(xué)研究k我們將 dsDNA/GCE 在 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中充分富集后放入 BR 空白液中進(jìn)行微分脈沖伏安掃描，考察了 Cu(Phen)(PC)(H2O) 在修飾電極上的解離動(dòng)力學(xué)過(guò)程。圖5為 dsDNA/GCE 經(jīng)過(guò)不同解

29、離時(shí)間 t 得到的 DPV 曲線。由圖可知，隨著時(shí)間的增加，配合物的還原峰電流越來(lái)越小，表明修飾電極表面的配合物的吸附量越來(lái)越小。將峰電流的對(duì)數(shù) ln Ipc 對(duì)解離時(shí)間 t 作圖，發(fā)現(xiàn) ln Ipc 與 t 在兩種電極上呈良好的線性關(guān)系，表明配合物在 dsDNA/GCE 解離符合如下模式的一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程17：解離過(guò)程 Cu(Phen)(PC)(H2O)-DNA/GCE DNA/GCE + Cu(Phen)(PC)(H2O)解離過(guò)程 即有方程： ln Ip =-kt +a 其中k 為解離速率，a 為一常數(shù)。 根據(jù)圖5中插圖的直線關(guān)系， 得到 Cu(Phen)(PC)(H2O) 從 dsDNA/

30、GCE 上的解離速率為0.9222 s-1，并通過(guò)公式 t1/2 = ln 2/k 計(jì)算得一級(jí)動(dòng)力學(xué)解離半衰期t1/2= 0.775s。I/10-6A E/V圖5 飽和富集了 Cu(Phen)(PC)(H2O) 的 dsDNA/GCE 在 0.02mol/L pH 5 BR 空白液中的微分脈沖伏安曲線.插圖:還原峰電流對(duì)數(shù) ln Ipc 與解離時(shí)間 t 的關(guān)系曲線Figure 5 Time-dependent of DPVs obtained in 0.02 mol/L pH 5 BR solutions at dsDNA/GCE Inset: plots of ln Ipc and t. A

31、rrows show the dissociation process accompanied with the increase of dissociation time.3.2 GCE修飾電極電化學(xué)表征 圖6為裸 GCE GCEox ; 和S1/GCEox 三支不同電極在 5 mmol/L K3Fe(CN)6 溶液中的循環(huán)伏安圖。在裸 GCE上幾乎測(cè)不到阻抗，所以得到一對(duì)明顯的氧化還原峰， E0=0.25 V，對(duì)應(yīng)于(圖6 a )；在GCEox上，由于阻抗增大，電對(duì)的峰電流較GCE 上有所減小，對(duì)應(yīng)于(圖6 b )；在S1/GCEox上，由于修飾上S1，似的阻抗更大，電對(duì)的峰電流也相對(duì)的減

32、小，對(duì)應(yīng)于(圖6 c )。Ip/10-5A E/V圖6 K3Fe(CN)6在裸 GCE (a), GCEox (b) 和 S1/GCEox (c) 上的循環(huán)伏安圖 Figure 6 CVs of K3Fe(CN)6 at bare GCE (a), GCEox (b) and S1/GCEox (c) 5.0 mmol/L K3Fe(CN)6 + 50.0 mmol/L KCl.圖7 K3Fe(CN)6 在裸 GCE (a) , GCEox (b) 和 S1/GCEox (c) 上的阻抗圖 Figure 7 EISs of K3Fe(CN)6 at bare GCE (a), GCEox (b

33、) and S1/GCEox (c) 5.0 mmol/L K3Fe(CN)6 + 50.0 mmol/L KCl.3.3 基因靶序列的定量檢測(cè) 將 S1/GCEox 浸入不同濃度互補(bǔ)鏈(S2)溶液中在 42 ºC水浴中雜交 1 h 后取出洗，然后放入 Cu(Phen)(PC)(H2O) 中富集飽和后進(jìn)行 DPV 測(cè)定，考察峰電流 Ip 與互補(bǔ)鏈濃度的關(guān)系結(jié)果如圖8 A 所示。隨著互補(bǔ)鏈濃度的增大，在雜交電極上獲得的峰電流越來(lái)越多，表明修飾電極表面上的雙螺旋DNA量越來(lái)越大。將峰電流 Ipa 與濃度對(duì)數(shù) logCT 作圖，在 5.0×10-131.0×10-8 m

34、ol/L 范圍內(nèi)，Ipa 與 logCDNA 呈良好的線性關(guān)系(圖8 B)， Ipa/(A)= 0.46 log(CT/mol/L) + 6.24， =0.998。這表明在本實(shí)驗(yàn)中，以 GCEox 為載體固定 DNA 探針，以 Cu(Phen)(PC)(H2O) 為電化學(xué)雜交指示劑能在將峰電流Ipa與濃度對(duì)數(shù) logCT 作圖，在 5.0×10-101.0×10-8 mol/L 范圍內(nèi)，Ipa 與 logCDNA 呈良好的線性關(guān)系(圖8 B)，Ipa/(A)= 0.46 log(CT/mol/L) + 6.24， =0.998。能在較低的濃度范圍內(nèi)對(duì)DNA片段進(jìn)行定量檢測(cè)。

35、AIp/10-6AE/VBIp/10-7A logCT圖8不同濃度靶序列CT對(duì)微分脈沖氧化曲線的影響(A); Cu(bpy)(MBZ)2氧化峰電流Ipa與S2濃度對(duì)數(shù)log CT的關(guān)系曲線(B) Figure 8 Dependence of DPVs of Cu(bpy)(MBZ)2 on the concentration of target sequence CT (A), and the plot between oxidation peak currents of Cu(bpy)(MBZ)2 Ipa and logarithmic of CT, log CTOther conditio

36、ns are the same as Figure 8-13. 3.4 傳感器的選擇性 因?yàn)樵诒緦?shí)驗(yàn)中采用微分脈沖伏安法能得到更靈敏的電化學(xué)信號(hào)，我們采用微分脈沖伏安法來(lái)研究傳感器的基因雜交傳感性能。圖9為 S1/GCEox 與不同基因片段 (S2 ，S3 , S4) 雜交前后在 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中進(jìn)行DPV掃描得到的電化學(xué)曲線。由圖可知，雜交前，配合物在 S1/ GCEox 上于-0.20 V 處有一對(duì)應(yīng)于配合物的氧化峰(圖9曲線a)；當(dāng)S1/GCEox 與1.0×10-6mol/L 非互補(bǔ)鏈(S3)雜交后，在 S1-S3/GCEox 上，只能得到一個(gè)較雜交

37、前相近的氧化峰(圖9曲線b)，表明電極表面的探針鏈S1與S3沒(méi)有發(fā)生雜交作用，電極表面仍保持單鏈狀態(tài)，從而獲得如 S1/GCEox 相似的氧化峰;當(dāng) S1/GCEox 在 1.0×10-6 mol/L 基本互補(bǔ)序列(S4)中浸泡雜交1 h 后，在相同的 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中得到一個(gè)較強(qiáng)的氧化峰(圖9曲線 c )，表明 S1 與 S4 在電極發(fā)生大部分雜交，配合物在S1-S4修飾電極表面產(chǎn)生了富集；當(dāng) S1/GCEox 在 1.0×10-6 mol/L 互補(bǔ)序列(S2)中浸泡雜交1 h 后，在相同的 Cu(Phen)(PC)(H2O) 溶液中得到一個(gè)明顯

38、增強(qiáng)的氧化峰(圖9曲線 d )，表明 S1 與 S2 在電極發(fā)生雜交形成了雙螺旋結(jié)構(gòu)，配合物在 S1-S2 修飾電極表面產(chǎn)生了富集;。這些結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)修飾電極對(duì)探針的固定方法和 Cu(Phen)(PC)(H2O) 指示劑的應(yīng)用對(duì)電化學(xué)檢測(cè)非互補(bǔ)和互補(bǔ)PAT基因具有良好的選擇性。Ip/10-6AaE/V圖9 S1/GCE(a)與非互補(bǔ)鏈靶序列S3(b),基本互補(bǔ)鏈靶序列S4(c)，非互補(bǔ)鏈靶序列S2(d),雜交后在 Cu(Phen)(PC)(H2O) 中檢測(cè)的微分脈沖伏安曲線 Figure 9 DPVs of Cu(Phen)(PC)(H2O) at S1/ GCE without (a),

39、hybridized with non-complementary sequences S3 (b), and complementary sequences S4 (c)，and complementary sequences S2 (d) Cu(bpy)(MBZ)2 + 0.02 mol/L pH 5 BR Pulse amplitude, 50 mV; Pulse width, 50 ms; Pulse period, 200 ms; Increasing potential, 4 mV.4.小結(jié)在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了配合物與 dsDNA 和 ssDNA 在電極表面相互作用的研究表明配合

40、物與 dsDNA 和 ssDNA 存在不同的結(jié)合力和結(jié)合模式，能作為一種 DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的電化學(xué)探針，計(jì)算了其與 ssDNA 和 dsDNA 的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)和電化學(xué)參數(shù)等。初步研究了 Cu(Phen)(PC)(H2O) 作為電化學(xué)雜交指示劑在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物基因片段 CaMV35S 中的應(yīng)用，結(jié)果表明該配合物在 CaMV35S 與互補(bǔ)序列雜交前后的修飾電極上能獲得差異性很大的電化學(xué)響應(yīng)，表明該配合物能作為一種潛在的電化學(xué)活性雜交指示劑。參考文獻(xiàn)：1 Gooding J J. Electrochemical DNA hybridization biosensors, Electro

41、analysis, 2002, 14: 1149-1156 2周文駿, 沈鶴柏, 楊永桃, 等. Tb3+熒光離子探針檢測(cè)三鏈DNA的形成, 光譜學(xué)與光譜分析, 2004, 24: 1605-1608 3 Zhao X, Tapec-Dytioco R, Tan W. Ultrasensitive DNA detection using highly fluorescent bioconjugated nanoparticles, Journal of the American Chemical Society, 2003, 125: 11474-11475 4 Wakeley P R, Er

42、rington J, Hannon S, et al. Development of a real time PCR for the detection of Taylorella equigenitalis directly from genital swabs and discrimination from Taylorella asinigenitalis, Veterinary Microbiology, 2006, 118: 247-254 5 Fitzmaurice J, Glennon M, Duffy G, et al. Application of real-time PCR

43、 and RT-PCR assays for the detection and quantitation of VT 1 and VT 2 toxin genes in E. coli O157:H7, Molecular and Cellular Probes, 2004, 18: 123-132 6 Volkmann H, Schwartz T, Bischoff P, et al. Detection of clinically relevant antibiotic-resistance genes in municipal wastewater using real-time PC

44、R (TaqMan), Journal of Microbiological Methods, 2004, 56: 277-286 7 Anna-Maria C, Ian K, Silvano P. Diagno. Rapid detection of mecA and nuc genes in staphylococci by real-time multiplex polymerase chain reaction, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2005, 51: 13-17 8 Tarja J, Arja K, Antti W L, et al. rapid solution hybridization method for detection of human papillomaviruses, Molecular and Cellular