轉(zhuǎn)基因鯉的生態(tài)安全檢測(cè)

1、轉(zhuǎn)基因鯉的生態(tài)安全檢測(cè)自1984年朱作言等成功建立魚類轉(zhuǎn)基因模型以來(lái)，許 多國(guó)家相繼開展了轉(zhuǎn)基因魚的研究，并取得了一定成果，魚 類基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的成功展示了魚類基因工程育種研究的廣 闊前景，轉(zhuǎn)基因魚也因其具有的優(yōu)越經(jīng)濟(jì)性狀和巨大的經(jīng)濟(jì) 效益，受到了人們的極大關(guān)注，然而轉(zhuǎn)基因魚要進(jìn)入商業(yè)化 生產(chǎn)還有一系列難題尚未解決，其中生態(tài)安全就是人們高度 重視的難題之一，與轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物比，魚類 具有特殊性，其活動(dòng)的地域廣泛，釋放到水體中，幾乎不能 回收，若轉(zhuǎn)基因魚不斷逃逸到天然水體中，可能會(huì)導(dǎo)致大量 外源基因進(jìn)入其野生同種或相近種基因組中，隨著種群的進(jìn) 一步擴(kuò)大，可導(dǎo)致遺傳同化，干擾其野生同種或

2、相近種的遺 傳背景，對(duì)種群的生態(tài)平衡產(chǎn)生難以估量的影響，因此，轉(zhuǎn) 基因魚生態(tài)安全性評(píng)價(jià)和檢測(cè)方法的基礎(chǔ)研究勢(shì)在必行，目 前一些研究小組正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因魚的中試研究，為商業(yè)開發(fā) 做準(zhǔn)備，但相關(guān)的安全性研究卻是空白，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)安全國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了一些基礎(chǔ)研 究，如雜交是否親和、基因漂移距離、影響花粉傳播的因素 等，但未見到有關(guān)轉(zhuǎn)基因魚生態(tài)安全檢測(cè)的報(bào)道，國(guó)外對(duì)轉(zhuǎn) 基因魚做過凈適合度方面的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并建立了轉(zhuǎn)基因魚的 基因飄散模型，但是沒有進(jìn)行基因組變異方面的檢測(cè)，筆者按一定比例將轉(zhuǎn)基因鯉與養(yǎng)殖鯉混合進(jìn)行自然交配，應(yīng)用 AFL P方法對(duì)其子一代基因組進(jìn)行掃描分析，同時(shí)以養(yǎng)殖鯉、 野鯉和松花江哈爾

3、濱江段鯉作為參照，檢測(cè)不同比例的轉(zhuǎn)基 因鯉親本對(duì)與養(yǎng)殖鯉交配的子一代基因組的變化，通過遺傳 多樣性，遺傳相似度和遺傳距離等遺傳學(xué)參數(shù)分析子一代基 因組的變異程度，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因鯉的安全性.1材料和方法1.1 材料1.2 DNA的制備及純度檢測(cè)1.3 AFLP 實(shí)驗(yàn)1.3.4 PCR擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增引物為1.4 數(shù)據(jù)處理2結(jié)果2.1 AFLP擴(kuò)增指紋圖譜2.2 多態(tài)位點(diǎn)及種內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)2.3 群體間遺傳距離及遺傳分化度3討論3.1 遺傳多樣性水平一個(gè)物種群體內(nèi)的個(gè)體基因水平互有差異，即遺傳多樣 性，通常表現(xiàn)由各種遺傳變異，進(jìn)而反映物種的進(jìn)化潛力及 對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，本研究采用AFLP方法對(duì)8個(gè)鯉群體進(jìn)行

4、分析，結(jié)果顯示8個(gè)群體的遺傳多樣性略偏低，Nei's多樣指數(shù)在0.2545到0.2076之間，Shannon信息指數(shù)在 0.3049到0.3737之間，對(duì)8個(gè)群體的IV。，IV。和 I比較顯示， 都是Y組最高，H組最低，總的趨勢(shì)是 Y>DZ>1%> 10%>25%>5 0%>60%>H多態(tài)位點(diǎn)的變化也具有相同的趨勢(shì)，說(shuō)明隨著轉(zhuǎn) 基因親本所占比例的增加，群體的遺傳變異在減少，遺傳多 樣性在變小，這是由于 Y組是撫遠(yuǎn)江段的野鯉，屬于野生種 群，遺傳資源尚未遭到破壞，保持了良好的遺傳多樣性.DZ養(yǎng)殖鯉多樣性要低于野生鯉，一是由于養(yǎng)殖鯉是人們經(jīng)過多 代

5、選育形成的，在累代選育中都篩選具有典型優(yōu)良性狀的少 量后代作為親本，這樣就不可避免的造成了后代的基因組多 態(tài)性降低；二是長(zhǎng)期的人工養(yǎng)殖實(shí)踐，使養(yǎng)殖鯉處于簡(jiǎn)單的 生態(tài)環(huán)境下（池塘養(yǎng)殖條件），維持生存和生長(zhǎng)過分的依賴 于不變環(huán)境條件，適應(yīng)環(huán)境變化和基因突奕的發(fā)生率減少導(dǎo) 致多態(tài)性下降，而筆者使用的轉(zhuǎn)基因鯉親本是由外源大馬哈 魚生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入養(yǎng)殖鯉魚受精卵所得，由于外來(lái)基因的 插入和不定點(diǎn)整合，改變了供體親本基因組的結(jié)構(gòu)，形成了 一個(gè)新的群體，當(dāng)其與養(yǎng)殖鯉進(jìn)行雜交時(shí)，隨著轉(zhuǎn)基因親本 比例的增加，子一代的遺傳特點(diǎn)就越傾向于轉(zhuǎn)基因魚，本實(shí) 驗(yàn)結(jié)果顯示隨著轉(zhuǎn)基因親本比例的增加其遺傳多樣性變小， 可以推測(cè)

6、得由轉(zhuǎn)基因魚由于轉(zhuǎn)入了外源基因，破壞了原有的 基因組結(jié)構(gòu)，使其遺傳多樣性降低.5個(gè)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)組的遺傳多樣性要高于 H組，即松花江哈爾濱江段的鯉，造成松花江哈爾濱江段的鯉的遺傳多樣性小的原因可能有2種：一是因?yàn)轲B(yǎng)殖鯉群體的入侵，與野生鯉交配導(dǎo)致多樣性條帶丟 失，遺傳多樣性下降；二是由于過渡捕撈及生態(tài)環(huán)境的破壞 使松花江哈爾濱江段的鯉的群體數(shù)量迅速減少，產(chǎn)生了生殖 瓶頸效應(yīng)，使某些基因從基因庫(kù)中丟失，其多態(tài)性降低，由 此可見轉(zhuǎn)基因魚如逃逸到自然界中，會(huì)對(duì)原有種群的遺傳多 樣性產(chǎn)生影響，且隨著轉(zhuǎn)基因親本數(shù)目的增加，其影響也在 增加，但就筆者檢測(cè)的結(jié)果看，轉(zhuǎn)基因魚對(duì)養(yǎng)殖鯉的影響要 小于目前各種因素包括

7、養(yǎng)殖的雜交鯉、人為的資源、環(huán)境破 坯對(duì)松花江哈爾濱江段的鯉的影響.3.2 遺傳距離分析AFLP 的優(yōu)點(diǎn)之一是能顯現(xiàn)由大量的多態(tài)性DNA片段，遺傳距離估算的精確性將隨著分析位點(diǎn)數(shù)的增加而增加，本研 究檢測(cè)了 663個(gè)位點(diǎn)，并對(duì)所有群體和每2個(gè)個(gè)體做了遺傳距離和相似性分析.Thorp23通過分析研究認(rèn)為不同物種 間的遺傳相似系數(shù)1=0.20.8 (遺傳距離 Do =0.20.8); 同科屬群體間1=0.50.9(D。=0.10.5);同種群體間1=0. 80.97(D。=0.030.2).本研究的8個(gè)群體之間遺傳相似 系數(shù) 1=0.7916 0.8740 之間，(Do =0.1347 0.2337

8、),理 論上講這8個(gè)群體應(yīng)該屬于同一種群，但是數(shù)據(jù)顯示，與分 類標(biāo)準(zhǔn)有些差異，可能是由于不同比例轉(zhuǎn)基因鯉對(duì)其后代產(chǎn) 生了較大的影響，特別是60族驗(yàn)組1=0.79160.819 I(D 。=0.19960.2337)已經(jīng)超生了同一種群的范圍；50%實(shí)驗(yàn)組I=0.8053 0.8588(D。 =0.1522 0.2166)與 25讀驗(yàn)組 1=0.7 916。8353 (D 。=0.18000.2337)也在不同程度上超生了 同一種群的范圍；DZ組和Y組的遺傳距離為0.1867，小于2 5% 50% 60%組和Y組的遺傳距離，同樣的 DZ和H組的遺 傳距離小于50%, 60%fi與H組之間的遺傳距離

9、， 可見當(dāng)轉(zhuǎn)基 因親本的比例較小時(shí)對(duì)子代的的影響不足以表現(xiàn)由來(lái)，但是 隨著親本比例的增加影響變大，有重建種群的趨勢(shì)，在用養(yǎng) 殖鯉構(gòu)建轉(zhuǎn)基因魚時(shí)，外源基因的插入在不同程度上導(dǎo)致了 內(nèi)源基因組結(jié)構(gòu)的改變，致使某些酶切位點(diǎn)改變甚至丟失，使其與雜交鯉的相似性變小，遺傳距離變大，1% 10% 25%,50%F口 60贖驗(yàn)組是養(yǎng)殖鯉與轉(zhuǎn)基因鯉的后代，在不同程度上遺傳了親本的特性，轉(zhuǎn)基因親本的比例越大就越接近轉(zhuǎn)基因 魚的特性，所以 1% 10% 25%, 50%PH 60喊驗(yàn)組在相似性 和遺傳距離上不同程度的偏向于轉(zhuǎn)基因鯉，特別是60%實(shí)驗(yàn)組，已經(jīng)與H組和Y組產(chǎn)生了較大的差距，而且比養(yǎng)殖鯉與 野生鯉的遺傳距

10、離大，以上數(shù)據(jù)可以看由混有不同比例的轉(zhuǎn) 基因鯉的后代基因組受到不同程度的影響，轉(zhuǎn)基因比例越大 表現(xiàn)由的越明顯，甚至影響到了種群的劃分，高比列的轉(zhuǎn)基 因親本對(duì)養(yǎng)殖鯉的基因組結(jié)構(gòu)影響較大.3.3 遺傳結(jié)構(gòu)與基因流基因流（IV。）揭示了群體間基因滲透及影響遺傳分化的 遺傳現(xiàn)象，基因流的變化離不開環(huán)境變化產(chǎn)生的選擇作用， 它使群體間基因及其頻率相對(duì)穩(wěn)定，許多學(xué)者認(rèn)為，在基因 流發(fā)生較少的地方，將來(lái)有希望產(chǎn)生特異的群體，如地理型、亞種、變種，根據(jù)鯉的生活和繁殖習(xí)性，基因流主要來(lái)源于 環(huán)境的選擇效應(yīng)和群體的遷移，它對(duì)形成群體的遺傳結(jié)構(gòu)和 基因流的強(qiáng)度有著密切的關(guān)系，基因流與遺傳分化度成反比 例關(guān)系，本研究

11、發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組遺傳分化度均小于0.5 ,且隨著轉(zhuǎn)基因親本的比例增加， 1% 10% 25% 50% ,60%實(shí)驗(yàn)組與 H組和Y組間遺傳分化度在增大，基因流在變小，就是說(shuō)群 體的遺傳多樣性主要來(lái)源群體內(nèi)部，且隨轉(zhuǎn)基因親本比例的 增加，來(lái)源于群體間的多樣性在增加，根據(jù) HamrickE241等 的觀點(diǎn)，Nm大于1時(shí)，基因流就足以抵制遺傳漂變的作用， 也同時(shí)防止了群體分化的發(fā)生；若Nm小于1,漂變就成為刻劃群體遺傳結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)因素，在本研究中，不同比例轉(zhuǎn)基因 親本與養(yǎng)殖鯉繁殖所得子代與野生鯉之間的基因流Nm都大于1,因此轉(zhuǎn)基因子代基因組的變化是由雙親引起的，還沒 產(chǎn)生遺傳漂變.8個(gè)鯉群的遺傳分化度（Gs。

12、）較高，群體間 存在一定程度的遺傳分化，群體間變異占總變異的34.49%基因流為0.9498 （小于1）,每2個(gè)群體間的基因流在 1.1352到2.3593之間，張春霖等報(bào)道青海湖裸鯉的遺傳分 化系數(shù)為0.1084 ,基因流為4.1114 ,與此相比鯉群體具有 較高的基因分化系數(shù)，且基因流較低，這可能與其生活習(xí)性 有關(guān)，青海湖裸鯉屬于生殖澗游的魚類，而鯉屬于非澗游性 魚類，地理隔離可以導(dǎo)致群體間的遺傳分化系數(shù)增大，基因 流值降低，另一方面群體間的基因流可能由于環(huán)境惡化和人 類活動(dòng)（過度捕撈、修建水庫(kù)）等造成的棲息地的片段化， 生境片段化使各群體在空間上相對(duì)隔離，在個(gè)體的遷移能力 不變的情況下，

13、基因流將降低，隔離距離越大，群體間的基 因流越小，從而導(dǎo)致群體間的遺傳分化增大.可以認(rèn)為，歷 史上野生鯉是廣泛分布的，基因在群體間有廣泛的交流，但 隨著近期的人為干擾、破壞和資源的過度開發(fā)利用，使得鯉 的生境片段化，造成有效群體較小，導(dǎo)致群體內(nèi)遺傳多樣性 下降，群體間遺傳分化較大，鯉的遺傳分化程度較高，群體 間基因流動(dòng)較弱，易受環(huán)境變化、遺傳漂變等隨機(jī)因素影響, 應(yīng)盡可能避免人為加速生境的片段化，而使基因流降低，同 時(shí)避免高比例的轉(zhuǎn)基因鯉的混入，高比例轉(zhuǎn)基因鯉親本、子 代與野生鯉魚的基因流要小于養(yǎng)殖品種與野生鯉的基因流， 由此可見，轉(zhuǎn)基因鯉對(duì)野生鯉產(chǎn)生的群體分化的影響要高于 養(yǎng)殖群體對(duì)野生鯉的影響，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因魚基因庫(kù)中有外 來(lái)的基因，而人工養(yǎng)殖群體基因庫(kù)卻是鯉本身原有的基因， 雖然由于人工選擇、雜交等因素形成了新的群體，改變了原 有基因組的結(jié)構(gòu)，但群體分化影響還是較少的，基因工程在造福人類的同時(shí)也帶來(lái)了一定的災(zāi)難，因此 必須從保障人類健康、發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和維護(hù)生態(tài)平衡與安全 的角度由發(fā)，提由具有指導(dǎo)意義和行之有效的措施，目前， 轉(zhuǎn)基因魚都是在有效的監(jiān)控下開展研究和養(yǎng)殖，對(duì)自然生態(tài) 環(huán)境的影響是微弱的，但是也存在逃逸的風(fēng)險(xiǎn)，一旦轉(zhuǎn)基因 魚逃逸到開放水體中，對(duì)環(huán)境中同種或相近種遺傳背景的干 擾是不能消除的，由本研究的檢測(cè)結(jié)果可以看由，高比例的 轉(zhuǎn)基因魚會(huì)對(duì)其后代基因組產(chǎn)生明顯的影