引物設(shè)計(jì)軟件oligo應(yīng)用圖解(共10頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上引物設(shè)計(jì)軟件oligo應(yīng)用圖解在專門的引物設(shè)計(jì)軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0的初始界面是兩個(gè)圖：Tm圖和G圖；Oligo 6.0的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了個(gè)Frq圖?！癘ligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。oligo的下載和安裝我就不多說了，打開oligo相信也無需多講。打開oligo的頁面如下：單擊file菜單再點(diǎn)open或點(diǎn)擊“打開”快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrlO”可打開下面的窗口：在打開的OPEN窗口內(nèi)選擇Fre

2、qSeq再點(diǎn)“打開”：選擇drosfr或者其它一個(gè)文件點(diǎn)擊“打開”：出現(xiàn)以下窗口，點(diǎn)擊“window”再點(diǎn)擊“Tile”：出現(xiàn)以下窗口，圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為Tm、G和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo 5.0，只是顯示更清楚了：G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的G值在5'端和中間值比較高，而在3&#

3、39;端相對(duì)低（如圖）。Tm值曲線以選取72附近為佳，5'到3'的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線為“Oligo 6”新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3'端Frq值相對(duì)較低的片段：再點(diǎn)擊Search再點(diǎn)“Fo'r Primers and probes”或使用快捷鍵F3： 出現(xiàn)以下窗口，點(diǎn)“OK”就OK了。當(dāng)然你也可以點(diǎn)擊“Prameters”和“Search Range”選擇你要的參數(shù)和你上下游引物的位置及你擴(kuò)增產(chǎn)物的長度：出現(xiàn)Search Status窗口，點(diǎn)“OK”： 出現(xiàn)Primer pairs窗

4、口，#代表引物對(duì)的編號(hào)，依次為引物對(duì)所處的位置、產(chǎn)物的長度、最適合的退火溫度、和GC的百分含量：點(diǎn)擊任一行出現(xiàn)“PCR”窗口，告知你擴(kuò)增片斷的位置，最合適的退火溫度等等信息：關(guān)掉“PCR窗口”和“primer Pairs窗口”回到原來的窗口你就能看到你引物的序列和位置，圖中手型鼠標(biāo)所指即為引物序列：至此引物設(shè)計(jì)已經(jīng)完成，你可以用“Analyse”菜單分析你的引物：有無引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等等：當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)并根據(jù)評(píng)價(jià)對(duì)引物進(jìn)行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（

5、cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測(cè)（非克?。┬訮CR，對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來說，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好。當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低。這種PCR需要通過靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，

6、這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。好了，oligo使用的簡單介紹到此結(jié)束。 在引物設(shè)計(jì)完之后可以使用軟件自帶的分析功能，操作如下：點(diǎn)擊“File”菜單中的“New Sequence”命令；在窗口中輸入上游引物；如果該引物的首位置不是1的話，可以在“Edit”窗口中輸入新的5端位置數(shù)字，如20；點(diǎn)擊Accept/Discard菜單的Accept命令；如果引物序列長度不同于當(dāng)前的引物的話，可以從“Change”菜單中改變當(dāng)前的引物長度；選取當(dāng)前序列為上游引物（點(diǎn)擊“upper”按鈕）；從Edit菜單中選取“Lower Primer”命令，在Edit Low

7、er窗口中輸入下游引物的序列；在Edit窗口的上角處，輸入相應(yīng)的5位置；選取“Accept and Quit”命令；如果想讓程序給出最佳退火溫度，在此時(shí)的對(duì)話框中輸入PCR產(chǎn)物的長度以及GC含量所占百分比，一般哺乳動(dòng)物的cDNA序列中GC大約占44。點(diǎn)擊OK就可以在“Analyze”菜單中完成各種分析了。關(guān)于引物的評(píng)價(jià)有幾點(diǎn)：duplex formation：這是評(píng)價(jià)引物二聚體形成的，包括自身形成二聚體和引物間二聚體，主要是看引物3端有無配對(duì)堿基(最好沒有)。其中的current oligo是當(dāng)你對(duì)引物進(jìn)行了編輯（如加入酶切位點(diǎn)）時(shí)，對(duì)原始引物進(jìn)行的分析。（下同）形成的二聚體要看能值G(得它不

8、會(huì)輸入?。?，能值越低越好，最好不要超過4.5（下同）。hairpin formation：這是看引物自身能否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，主要也是看3端不要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。還要看形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值，不超過4.5。如果引物中加入酶切位點(diǎn)，可能會(huì)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)且能值不會(huì)太低，這就需要靈活控制退火溫度了。composition and Tm：分析上下游引物的堿基組成，GC比和Tm值，原則我就不多說了。false priming site：如果模板不是基因組DNA，而是一個(gè)特定模板序列，需要進(jìn)行錯(cuò)配的分析，看你的引物（尤其3端）是否與特定模板的其他位點(diǎn)結(jié)合。一般錯(cuò)配的引發(fā)效率以不超過100為好，但并不絕對(duì)，如果正確結(jié)合位點(diǎn)的引發(fā)效率為450以上，而有一個(gè)錯(cuò)配的引發(fā)效率是120左右的，這個(gè)引物也是可以接