高效液相流動(dòng)相緩沖鹽選擇

1、下面內(nèi)容綜合了 Agilent和網(wǎng)上查到的一些資料：一般來(lái)說(shuō)，反相 HPLC的流動(dòng)相包括有機(jī)相和水相，有機(jī)相常用的為色譜甲醇和乙睛，不 太常用的還有四氫吠喃和異丙醇。甲醇有其性價(jià)比的優(yōu)勢(shì)，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發(fā)生反應(yīng)，而且甲醇在低波長(zhǎng)下有紫外吸收，會(huì)降低分析方法的靈敏度；乙睛雖然價(jià)格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強(qiáng)，很少與樣品發(fā)生反應(yīng)，用作流動(dòng)相系統(tǒng)壓力要比甲醇低很多，且截止波長(zhǎng)比甲醇低二20nm 增加了檢測(cè)出在低波長(zhǎng)下才有吸收的雜質(zhì)的可二| 能性，所以我們一般傾向于多用乙睛，少用甲醇。但是當(dāng)樣品峰形不好或者分離不好時(shí)，更換溶劑是一個(gè)很好的選擇，因?yàn)椴煌娜軇┛商峁┎煌倪x擇

2、性。|在反相色譜中，流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對(duì)條件微小變化不敏感的耐用方法中 非常重要。對(duì)于離子型化合物，典型樣品的保留隨pH改變而明顯變化，因此控制 pH對(duì)于保留和選擇性的穩(wěn)定非常重要，通常在pH24的條件下，保留時(shí)間對(duì) pH的微小改變穩(wěn)定性最高，因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH,包括堿性化合物和一般的弱酸?？紤]到重現(xiàn)性，所用的 pH應(yīng)高于或低于待分析物pKa或pKb上下一個(gè)pH單位。當(dāng)待分析物 pKa或pKb未知時(shí)，應(yīng)測(cè)試一種以上流動(dòng)相pH （如pH2.0和pH6.5緩沖鹽溶液），可提供最好結(jié)果。對(duì)流動(dòng)相的優(yōu)化主要體現(xiàn)在水相上。流動(dòng)相pH值對(duì)色譜分離的影響有

3、多鐘方式，根據(jù)待分析物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是非極性較強(qiáng)或中性的化合物， pH對(duì)分離度和保留的影響一般不明顯。如果是可離子化的化合物，如酸或堿，保留因子和 選擇性隨pH改變非常明顯。（1） 酸性分析物，應(yīng)選擇低pH緩沖液流動(dòng)相，以防止分析物離子化。 了解分析物的pKa, 才能有效的選擇流動(dòng)相 pH。緩沖范圍應(yīng)在其緩沖液離子 pK值土 pH單位，使流動(dòng)相的優(yōu) 化具有一定的靈活性。例如，醋酸鹽的 pKa為4.8,緩沖范圍為pH3.85.8 。（2） 堿性化合物，在高pH條件下才能得到其非離子形態(tài)，但這對(duì)色譜柱不利。通常許多堿性化合物在低 pH條件的保留就已經(jīng)滿足要求了，所

4、以可選擇低pH條件。如果選擇高pH條件，則注意需選擇耐強(qiáng)堿的色譜柱。水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改變pH值、改善峰形、提高分離度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。單純做液相時(shí)，低波長(zhǎng)下磷酸最合適；而做 液質(zhì)時(shí)首選三氟乙酸，或甲酸、乙酸。開發(fā)液相分析方法時(shí)流動(dòng)相可首選0.1%的磷酸水溶液，然后再以此為基礎(chǔ)做優(yōu)化。在單獨(dú)用酸不行的時(shí)候再考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、緩沖能力強(qiáng)、配制簡(jiǎn)單，需要調(diào)pH值時(shí)要有相應(yīng)的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，還有醋酸鹽，常用的鹽濃度在1020mM 左右（根據(jù)實(shí)際情況，有時(shí)可以選擇更低或更高濃度，建議最高

5、濃度不超過(guò)50mM ）。下表是 Waters提供的一個(gè)資料，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室建議使用的緩沖鹽體系。揮緩沖鹽/發(fā)性緩沖范圍?（土是否流動(dòng)相pKaMS兼 備注改性劑容？pH)TFA0.3-是是離子對(duì)試劑，能夠抑制MS信號(hào)，通常使用的濃度范圍0.020.1%乙酸4.76-是是同乙酸俊一起使用具有 最大的緩沖能力，通常使 用的濃度范圍0.11.0%甲酸3.75-是是同甲酸俊一起使用具有 最大的緩沖能力，通常使 用的濃度范圍0.11.0%乙酸鹽（俊鹽）4.763.765.76是是通常使用110mM濃度，注意鉀鹽和鈉鹽是非揮 發(fā)性的甲酸鹽（俊鹽）3.752.754.75是是通常使用110mM濃度，注意鉀鹽和鈉鹽

6、是非揮 發(fā)性的磷酸鹽12.151.153.15否否傳統(tǒng)的低pH緩沖體系，UV透光度很好磷酸鹽27.26.28.2否否當(dāng)pH超過(guò)7時(shí)，降低操 作溫度/緩沖鹽濃度以及 使用保護(hù)柱可以延長(zhǎng)色 譜柱壽命磷酸鹽312.311.313.3否否當(dāng)pH超過(guò)8時(shí)，降低操 作溫度/緩沖鹽濃度以及 使用保護(hù)柱可以延長(zhǎng)色 譜柱壽命4-甲基嗎啡琳8.47.49.4是是通常使用濃度為10mM或更少氨水 碳酸氫 俊9.210.3(H-CO3)9.2(NH+4 )8.210.28.211.3是是通常使用濃度為510mM （用丁 MS 工作 時(shí)保持離子源溫度超過(guò) 150 C）。用氨水或乙酸 調(diào)節(jié)pH值，在pH10時(shí) 具有很好的

7、緩沖能力。乙酸俊9.28.210.2是是通常使用濃度為110mM甲酸俊9.28.210.2是是通常使用濃度為110mM硼酸9.28.210.2否否降低溫度，減少濃度并使 用色譜柱來(lái)延長(zhǎng)柱壽命CAPSO（3-環(huán)己胺基-2-羥基丙磺酸9.78.710.7否否兩性離子緩沖液，同乙臘互溶，通常使用濃度為110mM ,氣味小Glycine甘氨酸2.4,9.88.810.8否否兩性離子緩沖液，比使用 硼酸鹽對(duì)柱子的損傷更 小些1-甲基哌噬10.29.311.3是是通常使用濃度為110mMCAPS10.49.511.5否否兩性離子緩沖液，同乙臘互溶，通常使用濃度為110mM ,氣味小三乙胺（乙酸10.79.711.