免疫學(xué)技術(shù)(單抗的制備)

1、整理ppt免疫學(xué)技術(shù) 單克隆抗體的制備整理ppt整理ppt整理ppt動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)種不同的B淋巴細(xì)胞系，具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。整理ppt 1975年年 Kohler & Milstein創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)，獲得創(chuàng)立單

2、克隆抗體技術(shù)，獲得19841984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)學(xué)獎(jiǎng) 創(chuàng)立者創(chuàng)立者：整理ppt1975年分子生物學(xué)家G.J.F. Kohler和C. Milstein在細(xì)胞雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫的小鼠的脾細(xì)胞，與小鼠的骨髓瘤細(xì)胞融合，并由此創(chuàng)建了第一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。這是免疫學(xué)乃至醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)里程碑。整理ppt 一是特異性，針對(duì)特定的單一抗原表位，它具有高度的特異性，抗腫瘤抗體藥物的研究表明，其特異性主要表現(xiàn)為特異性結(jié)合、選擇性殺傷靶細(xì)胞、體內(nèi)靶向性分布以及具有更強(qiáng)的療效。 二是多樣性，主要表現(xiàn)在靶抗原的

3、多樣性、抗體結(jié)構(gòu)的多樣性、作用機(jī)制的多樣性等方面。 三是定向性，抗體藥物可以定向制造，就是根據(jù)需要制備具有不同治療作用的抗體藥物?；谶@些特點(diǎn)，我們可以用來(lái)制成“生物導(dǎo)彈”運(yùn)送藥物至病害部位，主要是癌細(xì)胞，從而達(dá)到治療效果。整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt整理ppt1.致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備 2.骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備3.飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備4.細(xì)胞融合5.選擇性培養(yǎng)6.特異性抗體的檢測(cè)7.雜交瘤細(xì)胞的克隆化8.雜交瘤的凍存和復(fù)蘇9.單克隆抗體的大量制取10.單克隆抗體的純化整理pptu完全抗原：病毒、細(xì)菌、真菌等微生物和蛋白質(zhì)等分子量大于5000Da生物物質(zhì)u半抗原：多糖、藥物、激素、肽

4、類等分子量小于5000 Da 物質(zhì)（半抗原需與BSA、OA等載體交聯(lián)后成完全抗原才能刺激動(dòng)物產(chǎn)生可應(yīng)用的高效價(jià)的抗體）u動(dòng)物選擇：選擇體重1820g BALB/C 雌性小鼠，用制備抗原免疫。u抗原免疫：方式體內(nèi)、體外 劑量0.5-100g 次數(shù)視抗原而定 間隔視抗原而定 佐劑視抗原而定u收集時(shí)間：末次加強(qiáng)免疫后72-96h收集步驟一 致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備 整理pptu常用骨髓瘤細(xì)胞系：SP20、NS1、P3.653 u融合時(shí)骨髓瘤細(xì)胞的選擇： a.處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95 b.細(xì)胞株保持HGPRT（次黃嘌呤尿嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶）缺陷狀態(tài)步驟二 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備整理pptu常用飼

5、養(yǎng)細(xì)胞：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞，小鼠或大鼠胸腺細(xì)胞等。u飼養(yǎng)細(xì)胞主要作用： 可能在培養(yǎng)液中釋放某種生長(zhǎng)刺激因子； 滿足新生細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性; 減少聚苯乙烯培養(yǎng)板孔對(duì)新生細(xì)胞的毒性等步驟三 飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備整理ppt方法：方法： 電融合電融合 激光融合激光融合 離心融合離心融合 滅活的病毒融合滅活的病毒融合 聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：25步驟四 細(xì)胞融合整理ppt步驟五 選擇性培養(yǎng)HAT選擇培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T (Thymidine)：胸腺嘧啶

6、核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNA整理pptHAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，57天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，57天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻整理ppt對(duì)檢測(cè)方法的要求：靈敏度高 特異性強(qiáng) 簡(jiǎn)便快速常用檢測(cè)方法：ELISA、免疫熒光法步驟六 特異性抗體的檢測(cè)整理pptELISAELISA原理：原理：將抗原包被于酶標(biāo)板，與待檢雜交瘤細(xì)胞上清液反應(yīng)，如該上清液中含有特異性的抗體（一抗Ab），即可與酶標(biāo)二抗作用，加底物經(jīng)酶催化呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)OD值判定結(jié)果。ELISA整理ppt目的：建立單一細(xì)胞克隆方法：有限稀釋法，顯微操作法

7、，軟瓊脂培養(yǎng)法， FACS法克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽(yáng)性孔步驟七 雜交瘤細(xì)胞的克隆化整理ppt篩選陽(yáng)性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株。用HT培養(yǎng)液稀釋， 使細(xì)胞濃度為5060個(gè)/mL，于96孔培養(yǎng)板中每孔加0.1mL(五六個(gè)細(xì)胞/孔)。接種2排，剩余細(xì)胞懸液用HT培養(yǎng)液作倍比稀釋，再接種2排，如此類推，直至使每孔含0.52個(gè)細(xì)胞。按Poisson法計(jì)算，應(yīng)有36的孔為1個(gè)細(xì)胞/孔。培養(yǎng)710d后，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，爾后進(jìn)行抗原特異的ELISA測(cè)定，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。有限稀釋

8、法整理ppt特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法有限稀釋法整理ppt將細(xì)胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個(gè)細(xì)胞的線形液滴，在萊塞光激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光，此信號(hào)由光電倍增管接收，再結(jié)合細(xì)胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號(hào)，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號(hào)并與預(yù)定的信號(hào)對(duì)比，根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度及細(xì)胞大小不同，將細(xì)胞分成不同級(jí)別，在電場(chǎng)中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中。FACS法效率最高價(jià)格昂貴整理ppt凍存：慢凍，分步凍存， 室溫-20-70液氮意義：防止污染及變異 避免染色體丟失 防止非分泌細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng) 防止細(xì)胞密度過(guò)高而死亡復(fù)蘇：快融，取出立即浸入37-40水浴中， 使其迅速融化步驟八 雜交瘤的凍

9、存和復(fù)蘇整理ppt動(dòng)物體內(nèi)誘生：腹腔接種體外細(xì)胞培養(yǎng)：?jiǎn)螌蛹?xì)胞培養(yǎng)法，懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)步驟九 單克隆抗體的大量制取整理ppt取BALB/C 雌性小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。腹腔接種整理ppt總體上講，雜交瘤細(xì)胞系并不是嚴(yán)格的貼壁依賴細(xì)胞，因此既可以進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng)，又可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞的單層細(xì)胞培養(yǎng)法是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室最常用的手段，即將雜交瘤細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，以含10-15%小牛血清的培養(yǎng)基

10、培養(yǎng)，細(xì)胞濃度以1106-2106/ml為佳，然后收集培養(yǎng)上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。目前在雜交瘤細(xì)胞的大量培養(yǎng)中，主要有兩種類型的培養(yǎng)系統(tǒng)。其一是懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式的生物反應(yīng)器，其中包括使用微載體；其二是細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，包括中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。近來(lái)的研究表明，微載體培養(yǎng)法是雜交瘤細(xì)胞大量培養(yǎng)的理想途徑之一。體外細(xì)胞培養(yǎng)整理ppt1.辛酸硫酸銨沉淀法原理：先加正辛酸沉淀雜蛋白，后加硫酸銨 沉淀抗體。特點(diǎn)：成本較低，操作簡(jiǎn)單； 抗體活性損失??； 抗體純度高； 抗體回收率低； 需要高速冷凍離心機(jī)。步驟十 單克隆抗體的純化整理ppt2 親和層析法

11、：原理：利用蛋白A或蛋白G通過(guò)共價(jià)鍵聯(lián)接到活化的固相載體上，吸附抗體，然后采用改變pH值的方法將抗體洗脫分離。特點(diǎn)：抗體純度高； 純化速度快； 抗體回收率低； 抗體活性有損失； 成本高，費(fèi)用大。整理ppt整理ppt用于免疫的動(dòng)物，應(yīng)選擇與親本骨髓瘤細(xì)胞同一品系的動(dòng)物抗原免疫用的抗原盡量設(shè)法提高其純度，并保存其活性 融合劑PEG對(duì)細(xì)胞有毒性，一般采用分析純規(guī)格。濃度越高，對(duì)細(xì)胞 的毒性越大注意事項(xiàng)整理ppt操作中的污染，污染是雜交瘤技術(shù)中最常遇到的問(wèn)題，它往往可使一個(gè)即將建株的細(xì)胞毀于一旦。雜交瘤產(chǎn)生各種免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，究竟是哪種為主，則決定于抗原的免疫程序。免疫一次，且3天

12、后就取脾，多為產(chǎn)生IgM的B淋巴細(xì)胞。免疫多次的多為IgG。注意事項(xiàng)整理pptu優(yōu)點(diǎn) ： 在體外“永久”地存活并傳代 用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法 可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療u局限性 ： 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍 反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體 制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高單克隆抗體的優(yōu)缺點(diǎn)整理ppt1 .作為親合層析的配體單克隆抗體能與其相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，因而能夠從復(fù)雜系統(tǒng)中識(shí)別出單個(gè)成分。只要得到針對(duì)某一成分的單克隆抗體，利用它作為配體，固定在層析柱上，通過(guò)親合層析，即可從復(fù)雜的混和物中分離、純化

13、這一特定成分。與其它提取方法(沉淀法、高效疏水色譜法等)相比，具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)品活性高等優(yōu)點(diǎn)。單克隆抗體的應(yīng)用整理ppt2. 作為生物治療的導(dǎo)向武器脂質(zhì)體是由既親水又親油的兩親磷脂組成的連續(xù)雙分子層微囊，內(nèi)含水相空間，可包裹水溶性物質(zhì)。包有細(xì)胞毒劑的脂質(zhì)體膜上偶聯(lián)抗體，可定向攻擊靶細(xì)胞，稱為免疫脂質(zhì)體。這種“導(dǎo)向治療”，在動(dòng)物試驗(yàn)與體外試驗(yàn)中已獲得滿意效果。另外，可將化療藥物、細(xì)菌毒素、植物毒素或放射性同位素等細(xì)胞毒劑與抗腫瘤抗原的單克隆抗體直接交聯(lián)，利用其導(dǎo)向作用，使細(xì)胞毒劑定位于腫瘤細(xì)胞把它直接殺傷。這不僅提高了抗體的療效，也可降低細(xì)胞毒劑對(duì)正常細(xì)胞的毒性反應(yīng)。如應(yīng)用抗T細(xì)胞單抗和

14、柔紅霉素結(jié)合物，在體外對(duì)非T淋巴細(xì)胞就無(wú)殺傷作用。但是，要把這種方法應(yīng)用于臨床，目前還存在不少技術(shù)難關(guān)，包括人體對(duì)鼠源單抗的排異問(wèn)題等。單克隆抗體的應(yīng)用整理ppt3. 作為免疫抑制劑抗人T淋巴細(xì)胞單抗(McAb)作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應(yīng)。其作用機(jī)理有賴于McAb的種類及其免疫學(xué)特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的單抗，可以抑制小鼠同種皮膚移植的排斥反應(yīng)。此外，對(duì)用于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經(jīng)抗T細(xì)胞單抗加補(bǔ)體處理，能減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。單克隆抗體的應(yīng)用整理ppt4 作為研究工作中的探針單克隆抗體只與抗原分子上某一個(gè)表位(即抗原決定簇

15、)相結(jié)合，利用這一特性就可把它作為研究工作中的探針。此時(shí)，可以從分子、細(xì)胞和器官的不同水平上，研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，進(jìn)而并可從理論上闡明其機(jī)理。如用熒光物質(zhì)標(biāo)記單抗作為探針，能方便地確定與其結(jié)合的相應(yīng)生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸、酶等)在細(xì)胞中的位置和分布。單克隆抗體的應(yīng)用整理ppt6. 作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)試劑(1)診斷各類病原體這是單抗應(yīng)用最多的領(lǐng)域，已有大量診斷試劑商品供選擇。 (2)腫瘤特異性抗原和腫瘤相關(guān)抗原的檢測(cè) 用于腫瘤的診斷、分型及定位。盡管目前尚未制備出腫瘤特異性抗原的單抗，但對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的單抗早就用于臨床檢驗(yàn)。(3)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志 用于區(qū)分細(xì)胞亞群和細(xì)胞的分化階段。(

16、4)機(jī)體微量成分的測(cè)定 應(yīng)用單抗結(jié)合其它技術(shù)，可對(duì)機(jī)體的多種微量成分進(jìn)行測(cè)定。單克隆抗體的應(yīng)用整理ppt整理ppt絕大多數(shù)的mAb是用小鼠開發(fā)的，雖然可作為研究和診斷的工具，但它們至少在一定程度上不是理想的治療劑，因?yàn)樗麄冊(cè)谌祟愔杏忻庖咴?。也就是說(shuō)，小鼠抗體引入到病人體內(nèi)，將被病人的免疫系統(tǒng)識(shí)別為外源物質(zhì)，并將發(fā)生有損治療抗體利用的人抗鼠抗體（HAMA）應(yīng)答整理ppt鼠的抗體可被修飾成遺傳上更接近人的抗體。特別是鼠的IgG重鏈和鼠的輕鏈的恒定區(qū)在DNA水平上可以用人IgG1重鏈和輕鏈的恒定區(qū)所取代，以創(chuàng)建一個(gè)只有可變區(qū)（V）來(lái)源于鼠類的嵌合抗體。這明顯地降低但并沒(méi)有消除此抗體的免疫原性。另一種方法包括測(cè)定小鼠抗體重鏈和輕鏈的V區(qū)序列，然后將這些鏈的高變區(qū)的DNA序列插入人的IgG重鏈和輕鏈基因中。這樣產(chǎn)生的抗體95是人的，僅結(jié)合區(qū)是源于鼠的。單克隆抗體的人源化和嵌合體嵌合抗體人源化抗體整理ppt整理ppt通過(guò)人的B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，已經(jīng)制成了人的抗體，雖然這曾是十分困難的，并且通常在融合前需要用EB病毒感染以無(wú)限增殖B細(xì)胞。這種方法由于使用病毒而不理想，產(chǎn)生的mAb的特異性是有限的，抗體的產(chǎn)量也很少。最近，通過(guò)用人免疫球蛋白基因取代小