人參皂甙對應(yīng)激大鼠肝臟熱休克蛋白70表達的影響

1、人參皂甙對應(yīng)激大鼠肝臟熱休克蛋白70表達的影響 作者：李寧 金法 吳可人 徐濤 裘華森【摘要】 目的 研究人參皂甙對應(yīng)激時肝臟熱休克蛋白(HSP)70表達的影響，探討其抗應(yīng)激的作用機制。 方法 54只SD大鼠分為三組:干預(yù)組和模型組各24只，分別以人參皂甙溶液或生理鹽水灌胃；對照組6只，予正常飲食。采用盲腸結(jié)扎穿孔法（cecum ligation and perforation，CLP）制作應(yīng)激模型。分別于造模后6、12、24及72h檢測大鼠肝細胞HSP 70的表達及血清IL-6水平的變化。結(jié)果 除12h外，干預(yù)組肝細胞HSP70的表達均對照組（P0.05）。干預(yù)組72h肝細胞HSP70表達模

2、型組（P0.05）。干預(yù)組血清IL-6水平整體呈下降趨勢，除6h外，各時點明顯模型組（P0.05）。結(jié)論 人參皂甙可提高應(yīng)激時大鼠肝細胞HSP70的表達，并可抑制IL-6的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，保護應(yīng)激時的機體。 【關(guān)鍵詞】 人參皂甙 應(yīng)激 熱休克蛋白70 白細胞介素6【Abstract】Objective To study the effect and mechanism of panaxoside on the expression of liver heat-shock protein-70 in condition of stress. Methods 54 SD rats were d

3、ivided into panaxoside treating group（n=24）,which were fed with 0.5% panaxoside liquor at 50mg/kg via gastric tube , stress model group （n=24）and normal control group（n=6）. Cecum ligature and perforation (CLP) method were used to establish the model. The expression of HSP-70 and serum concentration

4、of IL-6 were evaluated at 6h, 12h, 24h and 72h after operation. Results In panaxoside treating group, the expression of HSP-70 was higher(p<0.05) than normal group at every time point except 12h, and in stress model group it is higher(p<0.05) than in normal group at 72h after operation

5、. IL-6 level were decreased after CLP in panaxoside group, and it was lower in panaxoside group than in stress model group 12h、72h after CLP (p<0.05). Conclusions Panaxoside can promote the expression of rat liver cell HSP-70 so as to protect body under stress and inhibit the production of IL

6、-6 in some way and release the inflammatory reaction.2 / 13【Key words】 Panaxoside Stress Heat-shock protein 70 Interleukin-6應(yīng)激是機體本能性地對于各種有害刺激作出的非特異性適應(yīng)反應(yīng)。嚴重感染、創(chuàng)傷、手術(shù)等應(yīng)激可誘發(fā)機體產(chǎn)生一系列適應(yīng)性反應(yīng)。 對機體而言，應(yīng)激的最終結(jié)果取決于應(yīng)激源的性質(zhì)、強度和持續(xù)時間，若上述因素超出一定的范圍，可使機體正常內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞、基礎(chǔ)疾病發(fā)生發(fā)展，甚至導(dǎo)致死亡。強烈應(yīng)激嚴重影響人類的身心健康，因此對抗應(yīng)激藥物的研究有重要意義。作者2006年12月7日

7、至25日，采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制作應(yīng)激模型，通過檢測大鼠肝細胞熱休克蛋白(HSP)70的表達及血清IL-6水平的變化，觀察人參皂甙對應(yīng)激時肝臟HSP70表達及炎癥反應(yīng)的影響，探討人參皂甙保護應(yīng)激機體的可能機制。1 材料與方法1.1 動物選用健康SD大鼠54只，體重約250g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。1.2 主要試劑及儀器人參皂甙（浙江省中醫(yī)院制劑室提供），實驗前用生理鹽水稀釋為0.5%的溶液備用；Rat IL-6 ELISA Kit（博士德公司產(chǎn)品）；兔抗人、小鼠、大鼠HSP-70多克隆抗體（博士德公司產(chǎn)品）；二抗（美國Zymed公司產(chǎn)品）。1.3 實驗方法應(yīng)激模型制備：大鼠

8、模型制備前12h禁食不禁水，稱重后用3%戊巴比妥腹腔注射（45mg/kg）麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，腹部脫毛消毒后，取下腹正中切口進腹，暴露盲腸后輕提出，用4號線環(huán)行結(jié)扎盲腸游離端1/3處（長約1.5 cm），注意避免損傷回盲部系膜血管，保持腸道暢通，用16號針頭在結(jié)扎端貫通穿刺2次，擠出少量糞便，將腸管回納入腹腔，用1號線單層連續(xù)縫合腹膜和皮膚，關(guān)腹，術(shù)后立即于雙側(cè)腹股溝皮下各注射1ml生理鹽水，以補充術(shù)中液體丟失。動物分組及處理：將動物隨機分為對照組（n=6）、模型組（n=24）及干預(yù)組（n=24）。干預(yù)組大鼠自由飲食，并以50mg/kg的0.5%人參皂甙溶液灌胃，1次/d；模型組以等量生

9、理鹽水灌胃 ；對照組自由飲食。喂養(yǎng)7d后模型組及干預(yù)組行CLP，術(shù)后繼予灌胃，術(shù)后6、12、24、72h分批麻醉后處死，每個時間點6只（自然死亡者拋棄），對照組在72h處死。均下腔靜脈采血1.5ml測定IL-6含量，并切取肝臟，將肝臟標本置于10%福爾馬林中固定、保存。血液標本分置于離心管中，分別標記，放入37水浴箱內(nèi)水浴0.5h，紅細胞等凝集沉積后，離心3000rpm、10min，吸取上清液，標記后置于-20冰箱內(nèi)冷凍保存待測。1.4 觀測指標及檢測方法血清IL-6測定：酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定，試劑購自博士德公司，嚴格按照試劑盒說明操作。免疫組化檢測肝細胞HSP70的表達：Envi

10、sion法免疫組化染色，光鏡下觀察HSP70的表達，結(jié)果用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文報告分析系統(tǒng)在低倍鏡下計算陽性面積百分比 (%)，每張切片隨機選取5個視野，求平均值。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以(x±s)表示，采用單因素方差分析處理，樣本均數(shù)間兩兩比較用q檢驗（SNK法）。取雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果 模型組大鼠于模型制備后6h死亡2只，72h死亡1只，拋棄，其余組大鼠無死亡。2.1 肝臟HSP70的表達 對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝竇清晰，竇內(nèi)上皮細胞、枯否細胞均未見明顯變化

11、，匯管區(qū)小葉間動靜脈、小葉間膽管結(jié)構(gòu)清晰，HSP70主要表達在匯管區(qū)周圍的肝細胞漿，呈放射狀，表達水平低，間質(zhì)細胞不表達。模型組大鼠肝細胞明顯腫脹，胞漿疏松，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇變窄，竇腔內(nèi)有膽汁聚集，門脈區(qū)有較多炎癥細胞浸潤，偶見點狀壞死，HSP70表達特點同對照組，但表達面積和強度呈不同程度的上升。干預(yù)組表達面積及強度較模型組稍高。造模后干預(yù)組除12h外，HSP70的表達均較對照組高（P0.05）；模型組于造模后24h之后才較對照組高（0.05）。干預(yù)組與模型組比較，造模后6、12及24h肝細胞的HSP70表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但72h干預(yù)組的肝細胞HSP70表達明顯較模型組高(P0.05

12、)。詳見表1、圖1。表1 人參皂甙對CLP大鼠肝臟HSP70表達的影響（略）注：與模型組比較，*0.05；與對照組比較P0.052.2 血清IL-6水平對干預(yù)組大鼠血清IL-6各時間點的水平進行兩兩比較，造模后6h明顯較其它時點高(P0.05)，總體水平呈下降趨勢；模型組大鼠IL-6水平總體呈上升趨勢。與模型組比較，干預(yù)組造模后12、72h的IL-6水平明顯較低(P0.05)；干預(yù)組造模后6h IL-6水平高于對照組（P0.05），12h后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。詳見表2、圖2。表2 人參皂甙對CLP大鼠IL-6水平的影響（略） 注：與模型組比較，P0.05；與對照組比較，P0.053

13、 討論 應(yīng)激是機體本能性地對于各種有害刺激作出的非特異性適應(yīng)反應(yīng)。諸多臨床和動物模型的研究表明，應(yīng)激可影響肝臟生理功能。應(yīng)激過程中產(chǎn)生的多種應(yīng)激激素、介質(zhì)和細胞因子可通過多種途徑導(dǎo)致肝細胞的損傷和功能變化，而肝細胞的損傷和功能改變，必將影響機體的應(yīng)激調(diào)節(jié)功能，進而影響機體的預(yù)后或轉(zhuǎn)歸。有研究證實去甲腎上腺素在肝臟產(chǎn)生IL-6有關(guān)鍵作用，予6-羥基多巴胺(6-OHDA, 一種化學(xué)性交感神經(jīng)阻斷劑)或手術(shù)切除肝交感神經(jīng)能抑制應(yīng)激導(dǎo)致的血漿IL-6升高。此外，Kitamura等發(fā)現(xiàn)，制動應(yīng)激可誘導(dǎo)肝臟IL-6 mRNA表達及血漿IL-6升高，并經(jīng)免疫組化分析，IL-6主要在肝實質(zhì)細胞表達陽性，而非間

14、質(zhì)細胞。 應(yīng)激狀態(tài)下，具有保護作用的蛋白質(zhì)表達也明顯增加，如急性期反應(yīng)蛋白、熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)等。HSP是一組高度保守的蛋白質(zhì)，是細胞內(nèi)一種內(nèi)源性具有保護作用的物質(zhì)，能夠增強機體或細胞對打擊的耐受，其中HSP70在正常細胞中表達水平較低，而在應(yīng)激狀態(tài)下可顯著地高表達，具有重要的細胞保護作用，。本研究結(jié)果顯示，造模后各組大鼠肝細胞HSP70的表達先后升高，與文獻相符，。 人參為扶正固本藥，能主補五臟，安精神，大補元氣，生津止渴，可挽救氣脫危癥及肺虛喘促、脾虛泄瀉、消渴少津等一切虛癥。人參皂甙是人參中的主要有效藥理成分, 能增加機體的抗應(yīng)激能力。一般認為，人

15、參皂甙能保護應(yīng)激期垂體-腎上腺功能,使之免于衰竭,進而有利于垂體-腎上腺功能的恢復(fù)。劉慶增觀察到人參提取液對內(nèi)毒素引發(fā)的致熱、白細胞驟降及休克死亡有較強的拮抗和防護效果，認為人參抗內(nèi)毒素作用是適應(yīng)原樣中藥，通過對機體反應(yīng)的影響，改變機體應(yīng)激狀態(tài)，提高機體對各種有害刺激的防御能力。本研究顯示，造模后72h干預(yù)組大鼠的肝細胞HSP70表達明顯較模型組高，表明人參皂甙能提高應(yīng)激時大鼠肝細胞HSP70的表達；干預(yù)組血清IL-6水平整體呈下降趨勢，盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)后12、72h明顯低于模型組，說明人參皂甙能減輕CLP后大鼠的炎癥反應(yīng)，對應(yīng)激大鼠有保護作用。 人參皂甙可提高應(yīng)激時大鼠肝細胞HSP7

16、0的表達，抑制IL-6的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，保護應(yīng)激時的機體，其確切機制尚待進一步探討?！緟⒖嘉墨I】 1 Nukina H, Sudo N, Aiba Y, et al. Restraint stress elevates the plasma interleukin-6 levels in germ-free mice. Neuroimmunol， 2001,115（12）:46.2 Kitamura H, Konno A, Morimatsu M,et al. Immobilization stress increases hepatic IL-6 expression in mice.

17、Biochem Biophys Res Commun，1997,238（3）:707.3 趙禎,安冬艷,秦麗娟,等. HSP70在經(jīng)熱應(yīng)激預(yù)處理后減少大鼠肝臟缺血再灌注損傷過程中的作用. 中國藥理學(xué)通報，2005,21(4):454.4 Kim YM, De-Vera ME, Watkins SC, et al . Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression. Journal of Biological Chemistry,1997,272(2):1402.5 Kano R, Abe K, Hase