檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的實驗技術(shù)6頁

1、in vivo：在體內(nèi) in vitro：在體外一、檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用 FRET技術(shù)（in vivo） FRET，F(xiàn)luorescence resonance energy transfer，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。該技術(shù)的原理是用一種波長的光激發(fā)某種熒光蛋白后，它釋放的熒光剛好又能激發(fā)另一種熒光蛋白，使其釋放另一波長的熒光，如下圖所示： 以下圖為例，若要利用FRET檢測兩種蛋白是否有相互作用，需將兩種蛋白的基因分別與這兩種熒光蛋白的基因融合，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出兩種融合蛋白。然后只需用紫外光對CFP進(jìn)行激發(fā)，并檢測GFP是否放出綠色熒光。如果能檢測到綠色熒光，那么可以說明這兩種蛋白可能有

2、相互作用；反之，則是這兩種蛋白沒有相互作用。 酵母雙、三雜交技術(shù)（in vivo）酵母雙雜交系統(tǒng)主要用于考察兩種蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域，即AD和BD。這些轉(zhuǎn)錄因子只有同時具有這兩個結(jié)構(gòu)域時才能起始轉(zhuǎn)錄。由此，設(shè)計不同的兩個載體，一個含有AD基因（假設(shè)為A載體），另一個含有BD基因（假設(shè)為B載體）。一般將一個已知蛋白的基因連在B載體上，作為誘餌(Bait)，將未知蛋白的基因連在A載體上，將這兩個載體都轉(zhuǎn)到特定的酵母細(xì)胞內(nèi)，看未知蛋白與已知蛋白是否有相互作用。如果兩者有相互作用，那么就可以啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄，從而使這個酵母細(xì)

3、胞能在選擇培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來或者生存下來；如果兩者無相互作用，那么報告基因就無法表達(dá)，那么這個酵母細(xì)胞就無法在擇培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來或者生存下來，如下圖所示： 由于酵母雙雜交系統(tǒng)不能鑒定膜蛋白間的相互作用，因此又發(fā)展出了分離泛素酵母雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理如下圖所示：如圖所示，將泛素蛋白拆分為兩個片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一個LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子，此時它并不能激活基因轉(zhuǎn)錄（因為它被限制在了C端段上，不能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用）。將該C端段連到一個膜蛋白上，將N端段連接到另一個膜蛋白上。若兩個膜蛋白有相互作用，那么兩個膜蛋白在相互靠近時會使泛素蛋白的N端段和C

4、端段靠近結(jié)合，形成一個完整的泛素蛋白。此時泛素蛋白酶體會將這一段被泛素標(biāo)記的片段降解，那么連接C端段的LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子掉落，即可進(jìn)入細(xì)胞核啟動標(biāo)記基因的表達(dá)。酵母三雜交的原理與雙雜交一樣，只是它研究的是兩個蛋白和第三個成分間的相互作用，通過第三個成分使兩個蛋白相互靠近。第三個成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下圖所示：如上圖所示，在加入第三種成分前，蛋白X與蛋白Y之間并無直接相互作用，因此無法使BD和AD靠近，報告基因不能表達(dá)；當(dāng)加入第三種成分后，蛋白X與蛋白Y的距離被拉近，BD和AD靠近，報告基因表達(dá)，從而可以被檢測到。 Pulldown技術(shù)（in vitro） Pulldown

5、，即蛋白沉降技術(shù)，它是建立在蛋白質(zhì)親和層析的基礎(chǔ)上的一種檢測蛋白質(zhì)間相互作用的分析方法。親和層析的原理如下圖所示，不同蛋白對配體的親和程度不同，因此可以先將非特異結(jié)合的蛋白用低濃度緩沖液給清洗出去，只剩目的蛋白與層析柱結(jié)合，然后再用洗脫液將目的蛋白洗脫下來，達(dá)到純化目的蛋白的作用。Pulldown技術(shù)利用的是親和層析技術(shù)以及特異的配體（如GSH或者鎳）。以下圖為例，將GST的基因與蛋白X的基因融合，表達(dá)出融合蛋白。將該融合蛋白的溶液過帶有GSH配體的層析柱，那么這一融合蛋白就能結(jié)合在配體上，然后將待測蛋白的溶液過柱，并讓其與融合蛋白反應(yīng)一段時間。接著開始進(jìn)行洗脫。如果待測蛋白與蛋白X無相互作用

6、，那么在開始清洗的時候就會被洗下來；如果在用洗脫液洗脫后才能在收集到的樣品中發(fā)現(xiàn)待測蛋白（以及蛋白X），說明待測蛋白與蛋白X可能有相互作用。 Far western blot（in vitro） Far western blot是基于western blot發(fā)展而來，其原理如下圖所示。將樣品蛋白用非變性的PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加入待測蛋白，使其與已在膜上的樣品蛋白進(jìn)行相互作用。接著加入帶有標(biāo)記（如HRP）的待測蛋白的抗體反應(yīng)，最后進(jìn)行顯色（如加入HRP的底物），觀察實驗結(jié)果。 免疫共沉淀（Co-IP）（in vivo）免疫共沉淀是探測活體細(xì)胞內(nèi)蛋白間的相互作用的一門技術(shù)。它的原

7、理是當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)有相互作用的蛋白Y也能沉淀下來。Co-IP的原理如下圖所示，首先從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，獲得蛋白提取液，并將其與抗體孵育，使抗體與蛋白X結(jié)合。將預(yù)處理過的protein G瓊脂糖珠（Sepharose）加入到抗體與蛋白提取液的孵育液中反應(yīng)，使抗體與protein G結(jié)合。通過離心將瓊脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用緩沖液將瓊脂糖珠沖洗數(shù)次，最后用western blot（或SDS-PAGE）進(jìn)行檢測。二、檢測蛋白質(zhì)與DNA相互作用 DNA foot prin

8、ting（in vitro） DNA foot printing的原理如下圖所示。將DNA的一個3端用32p標(biāo)記，然后將DNA分成兩份，一份直接用DNase 進(jìn)行不完全酶切；另一份先與待測蛋白混合反應(yīng)一段時間，然后再用DNase 進(jìn)行不完全酶切。然后將兩份樣品用變性的PAGE膠進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果。下圖中，由于待測蛋白與DNA結(jié)合的部位無法被DNase 酶切降解，因此它的電泳結(jié)果中與直接用DNase 進(jìn)行處理的樣品相比，會缺少一段；如果待測蛋白與DNA無相互作用，那么這兩組的電泳結(jié)果應(yīng)當(dāng)一致。 EMSA（in vitro） EMSA，Electrophoretic Mobility Shif

9、t Assay，又稱凝膠阻滯實驗。其原理是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA在Native-PAGE膠（非變性膠）上比沒有結(jié)合蛋白的DNA移動速率要慢，因此通過電泳即可看到DNA的變化，如下圖所示。 Screen a Phage cDNA-library by DNA probe（in vitro） 該方法又成為原位篩選法，用于檢測cDNA文庫中的蛋白與DNA探針之間的相互作用。其原理和實驗流程如下圖所示，首先是用噬菌體（phage）侵染大腸桿菌，然后將這些大腸桿菌涂到平板上。接著進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膜泡于IPTG水溶液中數(shù)小時，然后將該膜放于平板上，培養(yǎng)數(shù)小時（IPTG能誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)文庫蛋白）。將膜取出，進(jìn)行變性、復(fù)性和封閉（過夜），然后與放射性標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行反應(yīng)，最后洗膜、晾干并用膠片曝光。如果膠片上出現(xiàn)了條帶，說明該文庫蛋白與DNA探針有相互作用；反之則說明兩者無相互作用。 酵母單雜交系統(tǒng)（in vivo）酵母單雜交系統(tǒng)的原理與雙雜交一樣，不同的是它主要用于考察cDNA文庫中的蛋白與DNA（即特異的已知靶因子）是否有相互作用。其原理如下圖所示。首先需要構(gòu)建一段序列（黑框），它含有至少3個拷貝的特異的已知靶