A細(xì)胞工程—植物花粉和花藥培養(yǎng)

1、1會計學(xué)A細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物花粉和花藥培養(yǎng)植物花粉和花藥培養(yǎng)第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)花粉和花藥的培養(yǎng)花粉和花藥的培養(yǎng)(pollen and anther culture) 是指在人工是指在人工合成合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑改變花粉的發(fā)育途徑, 使其不形成配子，而像體細(xì)使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂胞一樣進(jìn)行分裂分化，由單個花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。分化，由單個花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)單倍體植物單倍體植物( (haplobiont) )用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株。用離體培養(yǎng)花藥的

2、方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)、花粉培養(yǎng)；胚珠或子房培養(yǎng)（未受精）一、概念一、概念第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)供體植株供體植株小孢子（小孢子（n）花培花培花粉植花粉植株（株（n）雄核發(fā)育雄核發(fā)育自然加倍自然加倍人工加倍人工加倍純合植株純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系一年內(nèi)獲得純系常規(guī)育種需常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。1、作物育種、作物育種常規(guī)育種在雜交常規(guī)育種在雜交F5、F6代開始選擇；花藥代開始選擇；花藥培養(yǎng)在培養(yǎng)在F1或或F2代進(jìn)行培養(yǎng)，再人工加倍處代進(jìn)行培養(yǎng)，再人工加倍處

3、理縮短育種周期理縮短育種周期3-5年年克服后代分離，大大縮短育種周期克服后代分離，大大縮短育種周期第二節(jié)第二節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用例子例子： 二倍體供體植株基因型為二倍體供體植株基因型為AaBbAaBb，若要從后代中選擇基因為，若要從后代中選擇基因為AAbbAAbb的純合單株的純合單株 常規(guī)方法常規(guī)方法： AAbbAAbb出現(xiàn)的概率為出現(xiàn)的概率為1/161/16，并且不能將，并且不能將AAbbAAbb與與AabbAabb、aAbbaAbb區(qū)分開。區(qū)分開。 AB aB Ab abABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBB aABb aaBbAbAabBAabB

4、AAbbAabbabaAbBaabB aAbb aabb 單倍體單倍體 二倍體二倍體AB- - AABBaB- aaBBAb- AAbbab- - aabb供體親本供體親本AaBb花培 從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規(guī)雜交，而從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率代群體中，選擇某一基因型的概率為為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的2n倍。倍。植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代當(dāng)代及時獲及時獲得突變個體，染色體加

5、倍后成為穩(wěn)定的純系。得突變個體，染色體加倍后成為穩(wěn)定的純系?；ǚ垭x體培養(yǎng)時，雄核發(fā)花粉離體培養(yǎng)時，雄核發(fā)育最適宜的時期一般是育最適宜的時期一般是第第一次有分裂或之前一次有分裂或之前。1、A A途徑途徑 小孢子第一次有絲分裂為非均等分裂，形成營養(yǎng)小孢子第一次有絲分裂為非均等分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞細(xì)胞和生殖細(xì)胞 （1 1）A-VA-V途徑途徑 由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （2 2）A-GA-G途徑途徑 由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （3 3）A-VGA-VG途徑（途徑（E E途徑）途徑） 由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞

6、各自獨立分裂，共同形成單倍體立分裂，共同形成單倍體 （4 4）C C途徑途徑 營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍體植株體植株2、B途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，近的兩個細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株或者核融合形成多倍體植株三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理三、雄核發(fā)育啟動機(jī)理四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)煙草花藥培養(yǎng)a) 球形

7、胚 d) 魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)部分花藥產(chǎn)生愈傷組織部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)3、機(jī)械游離、機(jī)械游離梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）具體方法具體方法2.看護(hù)培養(yǎng)圖解微室培養(yǎng)圖示：微室培養(yǎng)圖示：1滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液周圍加石蠟油周圍加石蠟油旁邊各加石蠟油旁邊各加石蠟油蓋蓋玻片蓋蓋玻片蓋蓋玻片蓋蓋玻片平視圖平視圖凹穴載玻片凹穴載玻片置培養(yǎng)皿中置培養(yǎng)皿中2628 恒恒溫培養(yǎng)溫培養(yǎng)取花蕾（鏡檢）取花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取

8、花藥取花藥消毒消毒分離花粉分離花粉第一節(jié)第一節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)愈傷組織發(fā)生愈傷組織發(fā)生（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理1 1、內(nèi)因、內(nèi)因供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時期。2 2、外因、外因預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時間等。3 3、機(jī)理、機(jī)理核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。小孢子發(fā)育時期小孢子發(fā)育時期對誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要。對誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要。（三）花粉發(fā)育時期（三）花粉發(fā)育時期適宜時期適宜時期：單核期：單核期,

9、尤其是單核中、晚期尤其是單核中、晚期(單核靠邊期單核靠邊期)Topas 10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,000 0.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty 10-100 0.001-0.01基因型胚狀體數(shù)量/106小孢子 成苗率（%）1 1、植株生長條件、植株生長條件 光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般 處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2 2、植株生長時期、植株生長時期 一般是開花始期優(yōu)于開花末期。一般是開花始期優(yōu)于開花末期。3

10、3、P P花粉的頻率花粉的頻率 不同溫度、日照時數(shù)、氮饑餓及生長物不同溫度、日照時數(shù)、氮饑餓及生長物質(zhì)處理提高質(zhì)處理提高P花粉的數(shù)量花粉的數(shù)量 雄配子體的發(fā)育雄配子體的發(fā)育 營養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞精子精子四分體四分體: 醋酸洋紅染色醋酸洋紅染色四分體四分體: Alexanders 染色染色單核期單核期雙核期雙核期成熟花粉粒成熟花粉粒處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子單核晚期單核晚期液泡液泡第一次有絲分裂后期第一次有絲分裂后期雙核早期雙核早期雙核中期雙核中期生殖核生殖核生殖核生殖核營養(yǎng)核營養(yǎng)核一般而言，單核期（第一次一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對誘導(dǎo)反應(yīng)最

11、有絲分裂前）對誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。敏感，為最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件形成雙核后，在合適的條件，主要由營養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生，主要由營養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生胚狀體。胚狀體。 發(fā)育時期發(fā)育時期物種物種減數(shù)分裂期減數(shù)分裂期草莓、番茄草莓、番茄四分孢子期四分孢子期葡萄葡萄單核早中期單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期單核早期至晚期煙草煙草單核早期至雙核期單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍(lán)梨、水稻、甘藍(lán)四分孢子期至雙核四分孢子期至雙核期期玉米玉米l對不同發(fā)育階段的花藥對不同發(fā)育階段的花藥

12、進(jìn)行培養(yǎng)測試進(jìn)行培養(yǎng)測試l確定最佳小孢子發(fā)育時確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征期的形態(tài)特征l注意形態(tài)特征會因品種注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化的變化而發(fā)生變化處于不同發(fā)育階段的煙草花芽處于不同發(fā)育階段的煙草花芽 花粉發(fā)育時期的確定花粉發(fā)育時期的確定醋酸洋紅染色DAPI 染色預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件 預(yù)處理目的：預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢

13、子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。量增加。 預(yù)處理方法預(yù)處理方法：主要是對花藥進(jìn)行適度的逆境處理，包括主要是對花藥進(jìn)行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。 （四）預(yù)處理（四）預(yù)處理預(yù)處理方法：預(yù)處理方法：3 3、其它、其它l包括包括射線、離心、磁場等射線、離心、磁場等。 （五）培養(yǎng)基（五）培養(yǎng)基 1.1.基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 主要為主要為N6和和MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。MS和和H培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；B5培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)

14、；適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。Nitsch培養(yǎng)基培養(yǎng)基:適合蕓薹屬和曼陀羅屬。適合蕓薹屬和曼陀羅屬。高濃度的高濃度的NH4+顯著抑制花粉愈傷組織形成。顯著抑制花粉愈傷組織形成。鐵鹽鐵鹽對花粉胚狀體發(fā)育很重要?；钚蕴看龠M(jìn)胚狀體發(fā)育對花粉胚狀體發(fā)育很重要。活性炭促進(jìn)胚狀體發(fā)育。 包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。u不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。在辣椒花藥培養(yǎng)中以6%的蔗糖濃度對胚狀體的誘導(dǎo)率為最高。u一般

15、認(rèn)為一般認(rèn)為單子葉植物單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。比雙子葉植物需糖的濃度要高。u玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。u較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織； 較低 濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。2.2.碳源碳源3 3、激素、激素 細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成； 生長素可誘導(dǎo)愈傷組織形成。 細(xì)胞分裂素與生長素比值高時可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗4 4、氨基酸、氨基酸5 5、活性碳、活性碳6 6、pHpH （六）培養(yǎng)條件（六）培養(yǎng)條件 1 1、溫度、溫度 物種間有差異，物種間有差異，培養(yǎng)溫度在培養(yǎng)溫度在2528左右左右2

16、 2、光照、光照 光暗交替培養(yǎng)，每天光暗交替培養(yǎng)，每天1218h的光照，光照強(qiáng)度的光照，光照強(qiáng)度200010000lx。3 3、植板密度、植板密度 植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。5103到到2104ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對低密密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對低密度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細(xì)胞分裂的空度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細(xì)胞分裂的空間，從則有利于胚狀體發(fā)生。間，從則有利于胚狀體發(fā)生?；ㄋ幗M織的存在對小孢子的胚性分裂具有明顯的促進(jìn)作用?；ㄋ幗M織的存在對小孢子的胚性分裂具有明顯的促進(jìn)作

17、用。但花藥壁損傷會釋放有毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。但花藥壁損傷會釋放有毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。（七）花藥壁因素（七）花藥壁因素一、倍性鑒定一、倍性鑒定二、染色體加倍二、染色體加倍第一節(jié)第一節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)孤雌生孤雌生殖殖孤雄生孤雄生殖殖無配子生無配子生殖殖也稱單性生殖，即卵不經(jīng)過受精也能發(fā)育成正常的新個體 配子體可以不經(jīng)過配子的結(jié)合，而直接產(chǎn)生孢子體的，這種現(xiàn)象叫做無配子生殖 預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體培

18、養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)萌發(fā)”形成小植株。形成小植株。選擇合適的供體植株（選擇合適的供體植株（F1？）？）倍性鑒定或染色體加倍1/21/2MS+IBA0.2mg/L+MS+IBA0.2mg/L+活性炭活性炭3 3g/L+g/L+蔗糖蔗糖2020g+g+瓊脂瓊脂7 7g/Lg/L第一節(jié)第一節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù) 孢子有大小兩型孢子有大小兩型,其大形者稱為大孢子其大形者稱為大孢子 胚囊細(xì)胞胚囊細(xì)胞 embryosac cell 是種子植物的大孢子，是由

19、胚囊母是種子植物的大孢子，是由胚囊母細(xì)胞減數(shù)分裂形成的單倍的細(xì)胞，相當(dāng)于苔蘚植物和蕨類植物的細(xì)胞減數(shù)分裂形成的單倍的細(xì)胞，相當(dāng)于苔蘚植物和蕨類植物的大孢子大孢子 被子植物和裸子植物花藥內(nèi)的花粉四分體也稱為被子植物和裸子植物花藥內(nèi)的花粉四分體也稱為小孢子小孢子. 孢子是生物所產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的細(xì)胞，能直接孢子是生物所產(chǎn)生的一種有繁殖或休眠作用的細(xì)胞，能直接發(fā)育成新個體。孢子一般微小，單細(xì)胞。發(fā)育成新個體。孢子一般微小，單細(xì)胞。 由于它的性狀不同，發(fā)生過程和結(jié)構(gòu)的差異而有種種名稱。由于它的性狀不同，發(fā)生過程和結(jié)構(gòu)的差異而有種種名稱。 生物通過無性生殖產(chǎn)生的孢子叫生物通過無性生殖產(chǎn)生的孢子

20、叫“無性孢子無性孢子”，如分生孢子、孢，如分生孢子、孢囊孢子、游動孢子等；囊孢子、游動孢子等； 通過有性生殖產(chǎn)生的孢子叫通過有性生殖產(chǎn)生的孢子叫“有性孢子有性孢子”，如接合孢子、卵，如接合孢子、卵孢子、子囊孢子、擔(dān)孢子等；孢子、子囊孢子、擔(dān)孢子等； 直接由營養(yǎng)細(xì)胞通過細(xì)胞壁加厚和積貯養(yǎng)料而能抵抗不良環(huán)直接由營養(yǎng)細(xì)胞通過細(xì)胞壁加厚和積貯養(yǎng)料而能抵抗不良環(huán)境條件的孢子叫境條件的孢子叫“厚垣孢子厚垣孢子”、“休眠孢子休眠孢子”等。等。第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)供體植株供體植株小孢子（小孢子（n）花培花培花粉植花