開題報(bào)告初稿

1、精品文檔多種特異性結(jié)核抗原聯(lián)合應(yīng)用檢測血清中結(jié)核抗體的探索一、 立論依據(jù)( 一 )結(jié)核病是臨床上常見而較難早期確診的疾病，血清學(xué)診斷可成為結(jié)核病的快速輔助診斷手段，但由于特異性欠強(qiáng)，敏感性低，尚需進(jìn)一步研究。結(jié)核病血清學(xué)方法主要是檢測血清和組織液中的特異性抗結(jié)核抗體。結(jié)核抗原的選擇至關(guān)重要。目前常用的抗原性物質(zhì)有3 種 : (1)結(jié)核菌蛋白 ; (2)結(jié)核菌胞壁脂多糖;(3)結(jié)核菌體。 由于結(jié)核抗原多而復(fù)雜，結(jié)核病患者的抗體譜呈現(xiàn)出多樣性。Lyashchenko等用 10種重組結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原檢測結(jié)核病患者血清中的特異性抗體，結(jié)果顯示近 90%的結(jié)核病患者血清中至少存在一種抗結(jié)核抗體，抗體

2、在體內(nèi)表達(dá)的數(shù)量、種類及水平可以隨患者的免疫背景、疾病的不同階段以及結(jié)核桿菌菌株的不同而不同。結(jié)核病患者的抗體反應(yīng)是針對(duì)多種結(jié)核抗原的，任何一種抗原都無法檢測結(jié)核病患者血清中所有的抗結(jié)核抗體，因此聯(lián)合多種抗原進(jìn)行檢測，在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于提高診斷的敏感性。目前血清學(xué)研究的主要方向是篩選多個(gè)純化的特異性抗原組成聯(lián)合抗原，以便增加血清學(xué)診斷的敏感性。近年來我國應(yīng)用基因工程技術(shù)克隆、表達(dá) MT 基因 , 簡便地獲得了大量MT 單一的蛋白抗原( 如 CFP10、 ESAT6、MPT63、 MPT64、 Ag85A、 Ag85B、 KatG、 16 000 、 38 000 、 65 000等蛋白

3、 )為我國應(yīng)用特異性結(jié)核抗原檢測血清中結(jié)核抗體提供了可能。( 二 )常見抗原： 脂阿拉伯甘露聚糖抗原(LAM)。 LAM是結(jié)核菌細(xì)胞壁上的主要脂多糖成分，它在生長中的結(jié)核菌表而能大量表達(dá)。LAM核心骨架為甘露聚糖，側(cè)鏈為甘露糖、 阿拉伯糖單位，分r 以磷脂酞肌醇 C MIP) 的形式錨在胞質(zhì)膜上，LAM抗原表位存在于阿拉伯甘露聚糖單位上。小同種間、 株間 LAM存在差異， 主要體現(xiàn)在其非還原端阿拉伯糖單位。構(gòu)成形式即花色上。 目前研究表明 LAM至少有兩種存在形式 : 來源于 HRa 的 ara LAM和來源于 HRv 的 man LAM?？?LAM抗體大多結(jié)合在 araLAM非還原端阿拉伯糖

4、單位抗原表位上，而具有毒性的 manLAM可能在疾病的致病過程中起著更為重要的作用。 Park 等 sa 對(duì)細(xì)菌學(xué)確診的 27例結(jié)核性腦膜炎患者發(fā)現(xiàn)， 23例 (85.2070) 結(jié)核患者腦脊液中 LAM-IgG為陽性，而無菌性腦膜炎及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病組78例患者中僅 3例陽性，特異性達(dá) 95.9070 。因此認(rèn)為檢測腦脊液中特異性 LAM抗體對(duì)結(jié)核性腦膜炎診斷有價(jià)值。 Park 等 )sa) 對(duì)細(xì)菌學(xué)確診的 27例結(jié)核性腦膜炎患者發(fā)現(xiàn)， 23例 (85.2070)結(jié)核患者腦脊液中LAM-IgG為陽性，而無菌性腦膜炎及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病組78例患者中僅 3例陽性， 特異性達(dá) 95.9070 。因

5、此認(rèn)為檢測腦脊液中特異性LAM抗體對(duì)結(jié)核性腦膜炎診斷有價(jià)值。 A60 抗原 是一種能被分解成單一成分的脂一多糖一蛋白集合物，是舊結(jié)素和PPD的主要組成成分。作為一種強(qiáng)有力的免疫原，能激發(fā)特異的免疫應(yīng)答及遲發(fā)型超敏反應(yīng) .在印度， Gupta等以 A60作為抗原檢測 4_52例結(jié)核及 161例對(duì)照兒童血清中特異性 IgM和 IgA抗體，敏感性為75.5070 ，特異性為 9207030 。對(duì)于 337例結(jié)核和 131例對(duì)照成人，IgG和 IgA 的敏感性達(dá) 91.6070 ，而特異性保持在90.007030CHiang32 等用 A60,38KDa,KP90作抗原分別檢測活動(dòng)性結(jié)核病人血清中相應(yīng)

6、的抗體， 結(jié)果顯示 A60作為血清學(xué)抗原比38KDa,KP90更有效。 Anuradha 等 33 檢測。1 歡迎下載精品文檔了神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核患者和其他肺外結(jié)核患者腦脊液和血清中的抗A60抗體，診斷結(jié)核病的準(zhǔn)確率為 75%。因此，對(duì)于肺外結(jié)核病，A60抗原同樣具有診斷價(jià)值。 14KDa 蛋白是 a一品狀小分 r 熱休克蛋白家族的成員。該蛋白攜帶有結(jié)核桿菌特異性的B細(xì)胞表位，用單克隆抗體檢測發(fā)現(xiàn)其至少存在四種小同的抗原決定簇，能誘導(dǎo)特異的體液免疫應(yīng)答。7ackett26和 Bothamely2'等研究發(fā)現(xiàn) :原發(fā)型結(jié)核病患者以及與痰涂片陽性的結(jié)核病患者密切接觸者的血清中，抗14KDa抗體滴

7、度升高，提示14KDa蛋白在感染初期就具有明顯的免疫原性。 CFP 10(Culturefiltrateprotein10) 與 ESAT-6同屬于一個(gè)家族，是山結(jié)核桿菌基因組RD 1區(qū)相同的操縱r 編碼的低分 r 量蛋白 t2 n，只存在于結(jié)核分枝桿菌群及其它幾種致病性分枝桿菌中，是T細(xì)胞的靶抗原，能誘導(dǎo)皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)步 刺激外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生特異性IFN- 。單獨(dú)用 CFP10作為抗原檢測結(jié)核病患者血清中特異性抗體，敏感性低。當(dāng)與38KDa蛋白聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，CFP10能檢測出對(duì) 38KDa抗原缺乏反應(yīng)的結(jié)核病患者血清特異性抗體，在保持高特異性的基礎(chǔ)上，可以彌補(bǔ) 38KDa對(duì)涂片陰性結(jié)核病

8、患者檢測敏感性的小足。 ESAT-6 (6KDa Early Secretory Antigenic Target)是從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中純化分離出的一種低分r 量分泌性蛋白，在結(jié)核桿菌感染早期階段就可被機(jī)體識(shí)別，具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性i 。通過對(duì)小同分枝桿菌的短期培養(yǎng)濾液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn) ESAT-6僅在結(jié)核分枝桿菌群 ( 包括人型分枝桿菌，牛型分枝桿菌和非洲分枝桿菌 ) 及其它幾種致病性分枝桿菌，如堪薩斯分枝桿菌、Szulgai 分枝桿菌、 海水分枝桿菌中表達(dá)， BCG及其它分枝桿菌小表達(dá) ESAT-6，因此，可以將 ESAT-6作為致病性結(jié)核分枝桿菌感染的特異性診斷試劑。有資料顯示

9、對(duì)ESAT-6發(fā)生體液免疫應(yīng)答者，70%以上發(fā)生的是高水平的抗體反應(yīng)，但是由于人的T胞對(duì) ESAT-6的識(shí)別受 MHC即 HLA的限制，因此，小同結(jié)核病流行地區(qū)的人對(duì)ESAT-6的反應(yīng)性是小相同的。 Ag8_5 復(fù)合體 是一組具有較強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白 i2 最早在結(jié)核分枝桿菌和 BCG的培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn) Ag8_5可在所有分枝桿菌菌種中引起廣泛交叉反應(yīng)3 ，說明分枝桿菌各菌株均可分泌?；顒?dòng)性肺結(jié)核病患者血清中Ag8_5水平比其它疾病患者和健康對(duì)照者高_(dá)50 1 _50信，因此可以通過檢測血液中的 Ag8_5，對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病加以診斷 Ag8_5復(fù)合體至少包括 A

10、g8_5A, Ag8_5B 和 Ag8_5C三種蛋白。 Ag8_5B分 r 量為 30KDa，是結(jié)核分枝桿菌的主要分泌蛋白，約占分泌蛋白總量的2207030070 0 在對(duì)結(jié)核病的診斷上，Ag8_5B較Ag8_5A和 Ag8_5C更有價(jià)值由于Ag8_5B蛋白廣泛存在于各種分枝桿菌中，而小同的分枝桿菌間存在抗原決定簇的差異，因此可能會(huì)影響檢測的特異性。 38KDa蛋白 (AgS,Pst-1,Pab)1986年， Young DS 等首次以單克隆抗體為基礎(chǔ)親和層析純化了38KDa蛋白。 1989年， Anderson AB6 等以 PBR322為載體，在大腸桿菌中以融合蛋白的形式表達(dá)了該蛋白。 3

11、8KDa蛋白是一種與磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的脂蛋白， 含有特異的 B淋巴細(xì)胞和 T淋巴細(xì)胞抗原決定簇， 對(duì)小鼠、 豚鼠和人類 B細(xì)胞具有免疫優(yōu)勢， 能誘導(dǎo)早期反應(yīng)。 Haslov 等 7 比較了 _5種結(jié)核桿菌抗原， 發(fā)現(xiàn) 38KDa蛋白的免疫學(xué)活性最強(qiáng)， 是結(jié)核桿菌的主要免疫原。 缺乏抗 38KDa抗體的血清很難與結(jié)核桿菌其它抗原發(fā)生反應(yīng)。 38KDa抗原對(duì)痰涂片陽性結(jié)核病的診斷具有較高的敏感性，但對(duì)痰涂片陰性結(jié)核病的診斷敏感性低。Wilkinson等9 以重組 38KDa蛋白為抗原檢測 225例結(jié)核病患者、 34例健康者、 24例其他疾病患者血清中特異性抗體，敏感性為 63.1 070 ，特異性為

12、 94.9070 0 其中，涂 (+) 培 (+) 患者敏感性為78.4070 ，明顯。2 歡迎下載精品文檔高丁涂 O)培 C)患者敏感性 37.7070, 76% 涂 C)培 (+) 患者血清中含有抗 38KDa抗體何秀云等 po 以重組 38KDa蛋白和 PPD為抗原檢測 BCG接種陽轉(zhuǎn)健康者， 38KDa檢測的特異性明顯高于 PPD，從某種意義上可以說， 38KDa抗原能將結(jié)核病患者與 BCG接種陽轉(zhuǎn)者區(qū)別開來，這可能與 BCG雖然具有編碼 38KDa蛋白的基因，但其蛋白的合成與表達(dá)受到抑制有關(guān)。( 三 )結(jié)核病血清學(xué)影響血清學(xué)診斷敏感性和特異性的因素很多，除所有抗原的特異性和純化程度、

13、 機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫狀態(tài)外，采用的檢測方法也是一個(gè)重要影響因素。目前用于血清血診斷的方法主要有： 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、斑點(diǎn)免疫金滲慮法以及免疫印記法。主要參考文獻(xiàn)1 吳雪瓊。我國結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷研究的主要進(jìn)展。中華結(jié)核和呼吸雜志，2003，26： 478.2 麗蓉，綜述，羅永艾， 等。結(jié)核病血清學(xué)診斷的新進(jìn)展，中華結(jié)核和呼吸雜志，25：269。3 王民。應(yīng)重視結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)診斷，中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005， 28： 770。4 中華結(jié)核和呼吸雜志編輯委員會(huì)?？菇Y(jié)核抗原的IGG 抗體測定 (ELISA 法 ) 在肺結(jié)核診斷的應(yīng)用。中華結(jié)核和呼吸雜志。1988 11: 2225 全國結(jié)核病流行病學(xué)抽

14、樣調(diào)杳技術(shù)指導(dǎo)組，全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)杳辦公室.2000 年全國結(jié)核病流行病抽樣調(diào)杳報(bào)告. 中國防瘩雜志，2002,24(2): 65二、研究目標(biāo)研究多種特異性結(jié)核抗原聯(lián)合應(yīng)用對(duì)結(jié)核血清學(xué)診斷的價(jià)值，從中找到最經(jīng)濟(jì)，靈敏度，特異度都較高的結(jié)核抗原組合。三、研究內(nèi)容通過 ELISA 法用各種結(jié)核抗原聯(lián)合診斷血清結(jié)核抗體。 七種抗原用正交分析方法分析其合理組合。四、擬解決的關(guān)鍵問題抗原種類數(shù)量較多，組合的方法也較多，會(huì)帶來較大的工作量和資金消耗。同時(shí)，抗原的取得和血清的來源也是較大的問題。五、研究方法、技術(shù)路線、試驗(yàn)方法采用高純度結(jié)核分支桿菌純蛋白衍生物作抗原, 應(yīng)用 ELISA 檢測血清抗結(jié)核抗體, 測定試劑盒可由生物公司提供 , 按試劑盒說明書操作 , 在終止反應(yīng)后 , 用酶標(biāo)儀、 波長 490nm 測定 A 值, 并以P/N ×100 計(jì)算,>105 為陽性 ( 其中P 為測定孔 A 值、N 為臨界孔 A 值) 。3 歡迎