EBVLMP2A和BZLF1融合基因重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

1、EBV LMP2A和BZLF1融合基因重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建【摘要】 目的 構(gòu)建EB病毒（EBV）潛伏膜蛋白2A(LMP2A)編碼基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重組腺病毒表達(dá)載體。方法 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分別獲得LMP2A和BZLF1編碼序列的cDNA，采用剪接式重疊延伸（SOE）技術(shù)將兩段基因通過(guò)多肽接頭(Gly4Ser)3 的DNA 序列進(jìn)行連接，構(gòu)建融合基因Z2A。將融合基因Z2A定向亞克隆到pAdTrackCMV 質(zhì)粒上，在原核細(xì)胞E.coli BJ5183中完成穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pAdEasy1的同源重組，構(gòu)建融合基因Z2A真核表達(dá)載體pAdZ2A。經(jīng)抗生素培養(yǎng)板篩選重

2、組體，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒vAdZ2A。結(jié)果 重組腺病毒載體經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切，電泳后可觀察到長(zhǎng)31 kb和4.5 kb 兩條DNA條帶，測(cè)序鑒定結(jié)果表明序列正確；從感染重組腺病毒vAdZ2A的293細(xì)胞中檢測(cè)到融合基因Z2A的表達(dá)。結(jié)論 本研究成功地構(gòu)建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重組腺病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究Z2A的功能提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 皰疹病毒4型 人 潛伏膜蛋白2A 基因 BZLF1 基因融合 表達(dá)載體 ABSTRACTObjectiveTo construct Z2A recombinant adenovirus vecto

3、r and study the effect of Z2A expression on EBVassociated tumor. MethodsBoth LMP2A and BZLF1 cDNA were cloned from B958 cell line by RTPCR, and the fusion gene (LMP2A2 / 20linkerBZLF1) was constructed by using a polypeptide linker (Gly4Ser)3. Z2A vector pAdZ2A was constructed by inserting the Z2A fu

4、sion gene into pAdeasy1 eukaryotic expressing plasmid, 293 cells were transfected with pAdZ2A. ResultsThe electrophoresis of EcoRV and Bgldigested products showed two DNA fragments which were 31 kb and 4.5 kb, respectively. The result of DNA sequencing demonstrated that Z2A had inserted in the expec

5、ted site and the insertion sequence was exactly correct. The results showed that Z2A positive recombinant adenovirus could express Z2A. ConclusionZ2A recombinant adenovirus vector has been constructed and can be used for further research. KEY WORDSherpesvirus 4, human; LMP2A; gene, BZLF1; gene fusio

6、n; expression vector EB病毒（EBV）是具有B淋巴細(xì)胞嗜性的皰疹病毒，為重要的DNA致瘤病毒，與多種人類惡性腫瘤,如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（NPC）、何杰金病、免疫缺陷病人的B淋巴細(xì)胞瘤、胃癌及肝癌等的發(fā)生有關(guān)。EBV對(duì)宿主細(xì)胞的感染有潛伏感染和裂解期感染兩種類型。研究表明，EBV陽(yáng)性癌組織中主要以潛伏感染的形式存在，EBV基因組存在于幾乎所有的癌細(xì)胞，因此可以EBV基因組或編碼產(chǎn)物為靶點(diǎn)對(duì)EBV相關(guān)腫瘤進(jìn)行特異性治療13。本研究擬將EBV潛伏膜蛋白2A(LMP2A)編碼基因和即刻早期基因(BZLF1)進(jìn)行融合，進(jìn)而構(gòu)建融合基因的重組腺病毒表達(dá)載體，為進(jìn)一步探討融合

7、基因表達(dá)對(duì)EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞增殖的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。 1 材料和方法 1.1 主要試劑、質(zhì)粒和細(xì)胞株 本文T4 DNA連接酶、DNA/Hind、DL2000 Marker、限制性內(nèi)切酶EcoR、Bgl均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。攜帶GFP報(bào)告基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV，E1 區(qū)和E3 區(qū)缺失的復(fù)制缺陷5型腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy1，大腸桿菌BJ5183和DH10B以及人胚腎293細(xì)胞由中 國(guó)疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵

8、一鳴教授惠贈(zèng)。EBV陽(yáng)性B958細(xì)胞系日本鳥(niǎo)取大學(xué)醫(yī)學(xué)部生體情報(bào)學(xué)教室西連寺剛教授惠贈(zèng)。 1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)LMP2A和BZLF1開(kāi)放讀碼框序列4，5，DNAStar軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增EBV LMP2A和BZLF1基因的特異性引物，并在LMP2A上游引物的5端引入Bgl酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基GGC，下游引物3端刪除終止密碼TAA，引入linker；BZLF1下游引物5端引入EcoR酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基GC，上游引物3端引入linker。linker(Gly4Ser)3為編碼15個(gè)氨基酸組成的疏水性多肽的DNA序列，序列為5GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGG

9、CGGCAGC3。 LMP2A上游引物P1序列為：5GGCAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGGTG3，下游重疊引物P2序列為：5GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCTACAGTGTTGCGATATGGGGT3。 BZLF1上游重疊引物P3序列為：5GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTG GCGGCAGCATGATGGACCCAAACTCGAC3，下游引物P4序列為：5GCGATATCTTAGAAATTTAAGAGATCCTCGTG3。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（PAGE純化）

10、，擴(kuò)增產(chǎn)物L(fēng)MP2A長(zhǎng)為1 545 bp，BZLF1長(zhǎng)為791 bp，融合基因長(zhǎng)為2 291 bp。 1.3 LMP2A和BZLF1基因的擴(kuò)增 采用TRIzol一步法提取B958 細(xì)胞總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求的標(biāo)準(zhǔn)條件合成cDNA用作PCR反應(yīng)模板。PCR反應(yīng)體系容量為25 L，包括10×buffer 2.5 L， MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 mmol/L，Taq 1 U，cDNA 2 L，無(wú)菌去離子水補(bǔ)至25 L。反應(yīng)條件為：94 預(yù)變性5 min；然后94 、60 s，55 、60 s，72 、90 s，擴(kuò)增35個(gè)循

11、環(huán)；最后72 延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙錠（0.5 mg/L）的8 g/L瓊脂糖凝膠中電泳30 min，紫外線透射儀下觀察電泳結(jié)果。 1.4 目的基因的TA克隆和測(cè)序 分別將LMP2A和BZLF1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入高效克隆載體pMD18T，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)菌中，在含有Xgal和IPTG的氨青霉素LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑選擇。TALMP2A和TABZLF1陽(yáng)性克隆由上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank中EBV標(biāo)準(zhǔn)株LMP2A和BZLF1編碼基因序列進(jìn)行比對(duì)。 1.5 融合基因Z2A 的構(gòu)建 以TALMP2A和TABZLF1質(zhì)粒為模

12、板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果分別獲得帶有l(wèi)inker互補(bǔ)序列的LMP2A和BZLF1片段。將LMP2A和BZLF1的PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，以其為模板在編碼(Gly4Ser)3多肽的DNA片段連接下，根據(jù)重疊延伸原理進(jìn)行基因重組7，獲得Z2A融合基因片段。將純化后的Z2A融合基因片段插入TA載體，提取質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行酶切鑒定和DNA序列分析。 1.6 重組腺病毒pAdZ2A的構(gòu)建 融合基因Z2A和腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdCMV分別用EcoR 和Bgl進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化DH5，培養(yǎng)后挑取白色單菌落，小量提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行pAdTrackCMVZ2A重組體的PCR篩選及酶切鑒定。 重組p

13、AdTrackCMVZ2A質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶Pme酶切線性化，并用堿性磷酸酶將線性化質(zhì)粒去磷酸化，與1 L (0.1 g)pAdEasy1質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BJ5183，將轉(zhuǎn)化的BJ5183 感受態(tài)菌液涂布于含35 mg/L卡那霉素的LB平板，37 培養(yǎng)1620 h。挑取較小菌落，在含卡那霉素（35 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中37 振搖培養(yǎng)1216 h，堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶Pac酶切后電泳進(jìn)行鑒定。如果right arm和left arm同源重組，重組質(zhì)粒用Pac酶切可產(chǎn)生4.5 kb左右的DNA片段；如果right arm與ori 同源重組，酶切產(chǎn)物

14、大小約3.0 kb，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pAdZ2A。 1.7 重組腺病毒的制備 在25 cm2培養(yǎng)瓶中接種293細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約為50%70%匯合時(shí)棄去培養(yǎng)基，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(lipofectamine 2000)使用說(shuō)明將帶有Z2A融合基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。在觀察到細(xì)胞熒光出現(xiàn)57 d后收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞，離心除去細(xì)胞碎片，取上清再次接種293細(xì)胞，如此重復(fù)34次。 1.8 RTPCR檢測(cè)Z2A mRNA 用重組腺病毒vAdZ2A感染293細(xì)胞，3 d后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄上清。采用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，將所獲得RNA加

15、入DNase消化處理可能污染的DNA后進(jìn)行RTPCR 檢測(cè)。取5 L用DNase消化處理的RNA直接作為模板進(jìn)行PCR作為對(duì)照，PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)鑒定。 2 結(jié) 果 2.1 目的基因的RTPCR擴(kuò)增 采用RTPCR技術(shù)自EBV陽(yáng)性B958細(xì)胞擴(kuò)增LMP2A和BZLF1編碼序列cDNA ，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)分別為1 545 bp和791 bp，結(jié)果見(jiàn)圖1。序列分析顯示LMP2A和BZLF1編碼序列cDNA與GenBank中標(biāo)準(zhǔn)毒株相應(yīng)序列一致。 圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ：PCR Marker DL2000；：陰性對(duì)照；、：BZLF1 PCR 產(chǎn)物；：LMP2A PCR產(chǎn)物 2.2

16、 融合基因PCR產(chǎn)物電泳和測(cè)序結(jié)果 融合基因Z2A PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2 291 bp，電泳結(jié)果與DNA準(zhǔn)分子質(zhì)量參照物DL15000比較，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)圖2。其測(cè)序結(jié)果也與LMP2A、BZLF1以及l(fā)inker的核苷酸序列比較一致。 圖2 融合基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ：Z2A 融合基因PCR 產(chǎn)物；、：LMP2A PCR產(chǎn)物；：PCR Marker DL2000；：DNA/Hind 2.3 腺病毒質(zhì)粒穿梭載體pAdTrackCMVZ2A的鑒定 融合基因Z2A經(jīng)Bgl和EcoR雙酶切后定向克隆入穿梭載體pAdTrackCMV，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAdTrackCMVZ2A，提取質(zhì)粒pAdTrac

17、kCMVZ2A行限制性核酸內(nèi)切酶Bgl和EcoR雙酶切分析，結(jié)果得到長(zhǎng)2 291 bp的融合基因片段和長(zhǎng)約9 200 bp的片段。見(jiàn)圖3。 圖3 重組質(zhì)粒pAdTrackCMVZ2A Bgl和EcoR雙酶切分析鑒定 、：Bgl和 EcoR雙酶切pAdTrackCMVZ2A產(chǎn)物；：陰性對(duì)照； ：PCR Marker DL2000；：PCR Marker DL15000 2.4 融合基因Z2A真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 pAdTrackCMVZ2A與pAdEasy1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化BJ5183發(fā)生同源重組獲得pAdZ2A重組體，對(duì)pAdZ2A重組體行測(cè)序分析，表明pAdZ2A真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，融合基因

18、Z2A片段插入正確。重組腺病毒載體攜帶2個(gè)獨(dú)立的CMV啟動(dòng)子表達(dá)盒，分別表達(dá)融合基因Z2A和GFP；轉(zhuǎn)染48 h后即在熒光顯微鏡下觀察到293細(xì)胞中GFP熒光(圖4)，可間接反映融合基因的表達(dá)。隨傳代次數(shù)增加，重組腺病毒感染性穩(wěn)定且增強(qiáng)，致細(xì)胞病變作用的時(shí)間縮短，通常傳至45代時(shí)，在接種病毒后2448 h，可觀察到幾乎所有細(xì)胞出現(xiàn)熒光，此時(shí)收獲病毒，重組病毒命名為vAdZ2A。提取重組腺病毒感染293細(xì)胞總RNA經(jīng)RTPCR擴(kuò)增，電泳顯示特異性2 291 bp預(yù)計(jì)大小的片段，結(jié)果見(jiàn)圖5。表明重組腺病毒在293細(xì)胞能有效轉(zhuǎn)錄。 圖4 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞 ×200 3 討 論

19、基因治療是將外源基因插入合適的表達(dá)載體再以重組載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，使目的基因在靶細(xì)胞或體內(nèi)高效表達(dá)，從而達(dá)到治療目的。在EBV相關(guān)腫瘤組織中，EBV只存在于癌細(xì)胞而正常細(xì)胞陰性，使靶向基因治療有可能通過(guò)EBV而實(shí)現(xiàn)?；跀y帶EBV及其產(chǎn)物是EBV相關(guān)腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)最大的特點(diǎn)，因此可發(fā)展以EBV為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療策略。 EBV即刻早期基因BZLF1編碼產(chǎn)物Z蛋白表達(dá),標(biāo)志病毒增殖進(jìn)入即刻早期，繼而與病毒基因組復(fù)制有關(guān)的許多病毒基因被活化，病毒進(jìn)入增殖早期，合成與病毒DNA復(fù)制相關(guān)的酶和DNA結(jié)合蛋白。隨后病毒DNA開(kāi)始復(fù)制，進(jìn)入增殖晚期，合成病毒結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成EBV膜抗原（MA）和EB

20、V衣殼抗原（VCA），在靶細(xì)胞核內(nèi)與病毒基因組組裝為成熟的病毒顆粒后經(jīng)細(xì)胞膜釋放，靶細(xì)胞隨之溶解死亡610。因此，可將外源性BZLF1基因?qū)隕BV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞中，誘導(dǎo)潛伏狀態(tài)的EBV進(jìn)入裂解期復(fù)制，EBV增殖后經(jīng)細(xì)胞膜釋放可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞溶解死亡，起到抗腫瘤的作用。 采用免疫學(xué)方法治療EBV相關(guān)腫瘤近年來(lái)已取得一定進(jìn)展，如可以通過(guò)誘導(dǎo)特異性CTL殺傷EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。EBV核抗原（EBNAs）和潛伏膜蛋白（LMP1和LMP2）是EBV相關(guān)腫瘤特異性治療中常被采用的靶抗原。EBNA1分子中含有豐富的甘氨酸丙氨酸重復(fù)序列，可影響HLA類分子對(duì)其的處理和遞呈；LMP1是重要的轉(zhuǎn)化基因，其編碼蛋白和

21、EBV細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能密切相關(guān)，故兩者都不適于作為EBV相關(guān)腫瘤免疫治療研究中治療性疫苗的靶抗原。而其他EBNAs和LMP2均含有能被具有MHC限制性的病毒特異性CTL識(shí)別的抗原表位，能介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞發(fā)揮作用，是較為理想的靶抗原11，12。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，體內(nèi)外EBV潛伏感染的所有B細(xì)胞中均有LMP2A表達(dá)，我們的研究結(jié)果也證實(shí)，約50%的EBV相關(guān)胃癌LMP2A陽(yáng)性，而且LMP2A是鼻咽癌、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的少數(shù)EBV保守抗原之一，具有潛在的T 細(xì)胞激活表位，能介導(dǎo)殺傷性T 細(xì)胞發(fā)揮作用6，11， 1316。因此，LMP2A可能成為EBV 相關(guān)腫瘤免疫治療的理想靶抗原。 我們將

22、LMP2A和BZLF1基因融合后構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體，同時(shí)發(fā)揮LMP2A誘導(dǎo)特異性CTL和BZLF1基因產(chǎn)物誘導(dǎo)潛伏期EBV進(jìn)入裂解期復(fù)制的作用，從而協(xié)同殺傷EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。表達(dá)載體采用當(dāng)今廣泛應(yīng)用的AdEasy系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在原核細(xì)胞E.coli BJ5183中完成穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒之間的高效同源重組，經(jīng)抗生素培養(yǎng)板篩選重組體，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞獲得重組病毒，從而簡(jiǎn)化了載體的構(gòu)建過(guò)程。本研究成功地構(gòu)建了表達(dá)EBV即刻早期基因BZLF1和潛伏膜蛋白基因LMP2A融合基因的重組腺病毒表達(dá)載體，并在293細(xì)胞中包裝獲得重組腺病毒vAdZ2A，應(yīng)用RTPCR鑒定結(jié)果表明vAdZ2A重組腺病毒可

23、在293細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步探討該融合基因在EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，同時(shí)發(fā)揮LMP2A誘導(dǎo)特異性CTL和BZLF1基因誘導(dǎo)潛伏期EBV進(jìn)入裂解期復(fù)制的作用，從而為協(xié)同殺傷EBV陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【參考文獻(xiàn)】 1BIGGS W H, MEISENHELDER J, HUNTER T, et al. Protein kinase B/Aktmediated phosphorylation promotes nuclear exclusion of the winged helix transcription factor FKHR1J. Proc Natl Acad Sci,

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