丙型肝炎病毒核心抗原的轉位表達與肝癌細胞凋亡的關系

1、丙型肝炎病毒核心抗原的轉位表達與肝（癌）細胞凋亡的關系 【關鍵詞】 ,C型肝炎病毒屬 關鍵詞: C型肝炎病毒屬;癌，肝細胞;蛋白表達 摘 要:目的 探討丙型肝炎病毒核心抗原的轉位表達與肝（癌）細胞凋亡的關系及其意義. 方法 采用免疫組織化學方法檢測HCV核心區(qū)抗原和NS3區(qū)抗原在肝硬變（LC）和肝細胞肝癌（HCC）組織中的分布，同時對連續(xù)切片進行原位凋亡檢測并計算凋亡指數(shù). 結果 HCV核心區(qū)抗原定位于肝細胞或肝癌細胞的胞質或胞核中，在LC組織中，核心抗原呈彌漫或灶狀分布于肝細胞胞質，偶見胞核陽性的肝細胞，陽性率為60.7%;核心抗原在癌組織中以核陽性分布為主，陽性率為37.6%，癌旁肝組織以

2、胞質陽性為多見.HCC中HCV核心抗原的核陽性率（75.0%，15例/20例）明顯高于其在LC（17.7%，6例/34例）及癌旁肝組織（11.8%，2例/17例）中的陽性率（P<0.05）;在HCC中，HCV核心抗原核轉位表達的癌組織的AI值（0.174±0.093）顯著低于胞質陽性的癌組織（0.512±0.113，P<0.01）.HCV NS3區(qū)抗原定位于肝細胞或肝癌細胞的胞質中，在LC和HCC組織中的陽性率分別為53.6%和39.6%.未發(fā)現(xiàn)HCV NS3區(qū)抗原的表達與肝（癌）細胞凋亡的相關性. 結論 HCV感染與我國LC，HCC的發(fā)生關系密

3、切，HCV核心抗原在肝癌組織中常發(fā)生核轉位表達，這種核轉位表達抑制了腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而促進腫瘤組織的進一步惡化. 1 / 13 Keywords:hepatitis C-like virus;carcinoma，hepatocellular;protein expression Abstract:AIM To analyse expression of HCV core protein and apoptosis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues of liver cirrhosis and hepatocellular carcino

4、ma.METHODS Immunohistochemistry method was used to show the dis-tributive pattern of HCV core and NS3antigen.Modified in situ end labeling（ISEL）was conducted on the serial sections.RESULTS Immunohistochemistry showed expression of HCV core protein in the liver cirrhosis of34/56cases and HCC of20/53c

5、ases.In liver cirrhosis and pericancerous tis-sues，the signals were mainly localized in the cytoplasm of hepatocytes.ISEL showed that only cells expressing core protein might initiated apoptosis.In cancerous tissues，translocated expression of HCV core protein was observed in the nuclei of tumor cell

6、s.According to ISEL on serial sec-tions，all these positive tumor cells hardly exhibited apoptosis（AI for nuclear positive，0.174vs AI for cytoplasmic posi-tive，0.152，P<0.01）.HCV NS3antigen was mainly dis-tributed in the cytoplasm of hepatocytes.We could hardly found the relationship between th

7、e expression of NS3and apoptosis in hepatocellular carcinoma.CONCLUSION HCV core protein may express in the nuclei of tumor cell.Translo-cated expression of HCV core protein may inhibit apoptosis in the tissue of hepatocellular carcinoma. 0 引言 自1989年Choo等克隆出丙型肝炎病毒（HCV）以來，各國學者從分子病理和免疫病理的角度尋找HCV與宿主相互作

8、用的關系，進行HCV特異性抗原的表達與HCV相關性肝疾病之間關系的研究，證實HCV感染是肝硬變（LC）、肝細胞肝癌（HCC）發(fā)生的一個重要危險因素1 .肝（癌）細胞的凋亡與HCC的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系.研究表明HCV的感染與肝（癌）細胞的凋亡有關2 .HCV核心區(qū)和NS3區(qū)基因編碼的蛋白具有較高的保守性.我們采用ABC法，對HCV核心區(qū)和NS3區(qū)抗原在LC，HCC組織中進行定位研究，進一步探討HCV與HCC發(fā)生的關系. 1 材料和方法 1.1 材料 均為我院1994/1996年外科手術切除標本，其中LC56例，HCC53例，45例帶有癌旁肝組織.所有標本經(jīng)100mL・

9、L-1 福爾馬林固定、脫水，常規(guī)石蠟包埋，制備5m厚連續(xù)切片，APES膠（Sigma，USA）對玻片進行處理以防脫片.HCV核心區(qū)抗原2B株單克隆抗體由軍事醫(yī)學科學院基礎所惠贈.HCV NS3區(qū)抗原單克隆抗體由北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院肝病研究所惠贈. 1.2 方法 采用Vector Lab公司生產(chǎn)的ABC試劑盒對石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，進行免疫組織化學染色，根據(jù)操作手冊進行，并做對照實驗.連續(xù)切片進行HE染色.原位凋亡檢測技術采用武漢博士德公司生產(chǎn)的原位末端標記試劑盒，根據(jù)操作手冊和已有文獻3進行，顯微鏡觀察，對福爾馬林固定石蠟包埋的組織片采用蛋白酶K（20mg・L-1 ，

10、15min，RT）消化和微波預處理.陰性對照為省去末端標記反應液，陽性對照用0.5g・L-1 DNA酶I（Sigma，USA）預先處理組織.結果判定是以核陽性為判定標準，根據(jù)凋亡細胞的典型表現(xiàn):染色質和細胞質顯著濃縮，染色質聚集呈環(huán)狀或新月體狀，細胞質的碎片合并有或沒有染色質的濃縮，細胞內(nèi)或細胞外染色質碎片. 統(tǒng)計學處理:隨機移動組織片，選擇相鄰的幾個視野，計數(shù)1000個細胞中的凋亡細胞數(shù)作為凋亡指數(shù)（AI）.采用2 檢驗和t檢驗. 2 結果 2.1 HCV NS3區(qū)抗原的分布特點和檢出率 應用HCV NS3區(qū)抗原單克隆抗體檢測LC和HCC中的相應抗原發(fā)現(xiàn):陽性信號見于肝

11、細胞和癌旁肝細胞的胞質中，呈細顆粒狀均勻分布，而在HCC細胞中少有表達.在LC及HCC組織中HCV的NS3區(qū)抗原的陽性率分別為53.6%（30例/56例）和39.6%（21例/53例）. 2.2 HCV核心抗原的分布特點和檢出率 應用HCV核心區(qū)抗原2B株單克隆抗體檢測LC和HCC中的相應抗原發(fā)現(xiàn):陽性信號見于肝細胞、HCC細胞的胞核或胞質中，呈細顆粒狀均勻分布.在LC中，核心抗原以胞質陽性為主，偶見胞核陽性細胞，分布多呈灶狀，匯管區(qū)小膽管上皮細胞偶可見陽性（Fig1）.在癌組織中，核心抗原以彌漫或灶狀核陽性分布 為多見，亦可見胞質陽性的HCC細胞（Fig2）.癌旁組織為彌漫或灶狀分布的胞質陽

12、性，分布類似于硬化組織（Fig3）.在LC及HCC組織中HCV核心抗原的陽性率分別為60.7%（34例/56例）和37.6%（20例/53例）.與NS3區(qū)抗原相比，核心抗原在HCC的癌組織中陽性率顯著增加（37.7%vs7.5%，P<0.05），而在癌旁肝組織和肝硬化組織中的陽性率無顯著性差異（Tab1）.2 檢驗表明，HCC組織中的核心抗原的核陽性率（75.0%，15例/20例）明顯高于其在LC（17.7%，6例/34例）及癌旁肝組織（11.8%，2例/17例）中的陽性率（P<0.05）. 表1 HCV核心抗原和NS3區(qū)抗原在LC，HCC中表達的陽性率略 2.3

13、LC和HCC中凋亡細胞的特征及AI 結果顯示，陽性信號為藍紫色顆粒，位于胞核，呈小圓形或環(huán)行.有些陽性細胞見于肝竇中，大約10m左右的小圓形顆粒，其形態(tài)難與淋巴細胞和Kupffer細胞區(qū)分.在LC中，陽性細胞在小葉內(nèi)多為散在分布于小葉周邊，靠近匯管區(qū)居多（Fig4）.而在癌組織中，既有散在分布的又有成簇分布的陽性細胞（Fig5）.在癌旁肝組織中陽性信號較前者少見.連續(xù)切片染色發(fā)現(xiàn)，在LC中，HCV核心抗原陽性的細胞部分發(fā)生了凋亡，并且AI明顯高于HCV陰性者（0.973±0.210vs0.439±0.172，P<0.05）.比較HCV核心抗原陽性的HCC及其癌

14、旁肝組織的凋亡指數(shù)，t檢驗顯示，HCV核心抗原核心核轉位表達的癌組織的AI值（0.174±0.093）顯著低于胞質陽性的癌組織（0.512±0.113，P<0.01），而癌旁組織的AI無顯著差異（0.418±0.191vs0.506±0.113，P>0.05），提示HCV核心抗原的核轉位表達抑制了腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而促進腫瘤的進一步惡化.HCV NS3區(qū)抗原的表達與AI之間未發(fā)現(xiàn)顯著的相關性. 3 討論 大量的流行病學研究表明，HCV與LC，HCC的關系非常密切，至少50%的感染者發(fā)展為慢性肝炎，約10%20%最終發(fā)展為LC

15、，甚至HCC4 .應用免疫組織化學方法對HCV相關抗原進行檢測，可為其提供直接的證據(jù).我們用HCV核心抗原和NS3區(qū)抗原的抗體檢測HCV RNA表達產(chǎn)物的分布情況，發(fā)現(xiàn)HCV感染與LC，HCC的發(fā)生關系密切，有較高的檢出率，分別為LC為60.7%和53.6%，HCC為37.6%和39.6%.結果顯示，HCV核心抗原有胞質表達陽性，也有胞核陽性，且在癌細胞中的胞核陽性率明顯高于其在LC與癌旁組織中的核陽性率.目前逐漸有關于核心抗原核表達陽性的報道.Suzuki等5 認為HCV核心抗原的核表達與HCV核心剪切蛋白的形成有關.他提出假說即表達全長cDNA的HCV的核心蛋白（Mr2200）定位于胞質是

16、由于在C末端功能域中存在錨著序列，它可使HCV核心蛋白錨著在內(nèi)質網(wǎng)膜上，而當C末端功能域受到細胞或病毒蛋白酶的編輯處理后，核心蛋白會轉位到核內(nèi).并且發(fā)現(xiàn)PRRGPR（3843殘基）的序列作為核定位信號起著重要的作用，這一序列在各種HCV株中都非常保守6 .另有研究表明HCV核心蛋白可能是一種基因調節(jié)蛋白5 .HCV可能通過其表達的蛋白產(chǎn)物間接致癌.認為HCV通過表達某種調節(jié)蛋白來影響肝細胞基因組的表達調控，從而向惡性發(fā)展. 圖1 圖5 略 目前，HCV核心抗原在HCC細胞中的核轉位表達，越來越受到國內(nèi)外學者的重視，推測它可能在HCC的發(fā)病機制中起一定的作用.有研究表明，HCV核心蛋白可在轉錄水

17、平調節(jié)多種原癌基因及病毒基因的表達.針對HCV核心蛋白與Fas系統(tǒng)介導的細胞凋亡的關系的研究，提示在慢性肝炎和LC中，HCV核心蛋白可能在肝細胞凋亡中起著重要的促進作用7 .而最近有文獻報道，HCV核心蛋白能夠抑制某些細胞發(fā)生凋亡8 ，并可與ras協(xié)同作用促進大鼠胚胎纖維母細胞惡性轉化9 .我們的研究結果顯示，在硬變肝組織中HCV核心蛋白的表達與肝細胞的凋亡有關.而在癌組織中出現(xiàn)的核心蛋白的轉位表達，又抑制了陽性細胞發(fā)生凋亡.HCV核心蛋白在細胞凋亡中表現(xiàn)的這種不一致性使我們推測HCV在慢性肝炎的進展過程中為了阻礙宿主細胞的防御功能，逐漸具備了擾亂宿主細胞凋亡調控機制的能力，即由誘導轉位抑制細

18、胞發(fā)生凋亡，并促進宿主細胞的惡性轉化，最終導致HCC的發(fā)生.因此研究HCV核心蛋白對多種凋亡相關基因的調控作用就顯得十分重要.HCV與細胞凋亡調控機制的研究目前尚屬少見.因此，以HCV核心蛋白為研究的突破口，探索其在HCV致病和致癌機制中的確切作用，并進而為研究針對HCC的防止措施提供重要的理論和臨床依據(jù). 參考文獻: 1Urdea MS，Wuestehube LJ，Laurenson PM，Wilber JC.Hep- atitis C diagnosis and monitoring J.Clin Chem，1997;43（8）:1507-1511. 2Higaki K，Yao H，Koj

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