p57kip2在肝癌組織中的表達及其與臨床病理因素、PCNA和p53的關(guān)系

1、p57kip2在肝癌組織中的表達及其與臨床病理因素、PCNA和p53的關(guān)系 作者：郭卉，南克俊，阮之平，景昭，劉陜西 【關(guān)鍵詞】 原發(fā)性肝癌 【Abstract】 AIM: To investigate the expression of p57kip2 and its relationship with clinicopathology, PCNA and p53 in primary hepatocellular carcinoma (HCC). METHODS: Expression of p57kip2, PCNA and p53 in tumor tissues from 32 pa

2、tients with HCC and 10 liver tissues of normal persons was detected with Elivision immunohistochemical technique. RESULTS: p57kip2 protein positiveexpression rate in HCC was 56.2%，which was lower than that in normal tissues (100%) (P=0.011). The reduced expression of p57kip2 protein correlated signi

3、ficantly with moderate or lowdifferentiation of tumor cells (P=0.007), high clinical stage (P=0.041) and poor prognosis (P=0.036), but did not correlate significantly with metastasis, tumor size, level of AFP and age (P>0.05). PCNA positiveexpression rate was 56.2%, which was correlated signi

4、ficantly with the expression of p57kip2 (P=0.036) and p53 positiveexpression rate was 46.9%, which was not correlated significantly with the expression of p57kip2 (P>0.05). CONCLUSION: There is a marked loss or absence of p57kip2 expression and high expression of PCNA in HCC, which are involv

5、ed in the carcinogenesis and development of HCC. p57kip2 and p53 may induce apoptosis via different mechanisms. 2 / 18【Keywords】 p57kip2 gene; HCC; PCNA; p53 【摘要】 目的：檢測細胞周期抑制因子p57kip2在肝癌中的表達水平，探討它與臨床病理因素、增殖細胞核抗原（PCNA）、p53的關(guān)系. 方法：用免疫組織化學法檢測32例肝癌組織和10例正常肝臟組織中p57kip2, PCNA和p53的表達水平. 結(jié)果：p57kip2在肝癌組織中的陽性

6、率56.2%，顯著低于正常肝臟組織（100%）（P=0.011），p57kip2的缺失表達與肝癌細胞的分化較差(P=0.007)、臨床分期較晚(P=0.041)及預后較差有關(guān)(P=0.036)，與年齡、AFP, 腫瘤大小及腫瘤侵犯轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)（P>0.05）；PCNA在肝癌組織中陽性率為56.2%，與p57kip2的表達有關(guān)(P=0.036)；p53在肝癌組織中的陽性率46.9%，與p57kip2表達在統(tǒng)計學上無相關(guān)性（P>0.05）. 結(jié)論：肝癌組織中存在p57kip2的表達缺失、PCNA的高表達, 共同參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，而p57kip2和p53可能通過不同

7、途徑來誘導細胞凋亡. 【關(guān)鍵詞】 p57kip2基因；原發(fā)性肝癌；增殖細胞核抗原；p53 0引言 細胞周期機制破壞是導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展的核心機制. p57kip2基因最早由Matsuoka等1發(fā)現(xiàn)，定位于染色體11p11.5，屬于CIPKIP基因家族. 在結(jié)構(gòu)上與p21、p27有部分同源性，通過抑制多種CDK活性從而使細胞俘獲在G1期. 具有抑癌基因的活性1. 增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表達與細胞增殖狀態(tài)密切相關(guān)2. p53是誘導細胞凋亡的重要基因，可間接反映細胞的凋亡情況3. 本試驗旨在探討p57kip2在肝癌組織中的

8、表達缺失情況及它與臨床病理因素、PCNA和p53的關(guān)系. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1標本西安交通大學第一臨床醫(yī)院2000/2002手術(shù)切除的肝癌標本32(男26，女6)例. 全組患者年齡2672（49.2±12.3）歲， 所有患者術(shù)前未經(jīng)過化療和放療. 組織學分級32例中級3例，級14例，級11例，級 4例；TNM分期，期2例，期16例，期10例，期4例. AFP陽性15例. 所有病例均經(jīng)病理學證實. 所有標本經(jīng)40 g/L甲醛固定，石蠟包埋，4 m切片，應用多聚賴氨酸包被，用作免疫組化研究 . 對所有蠟塊HE染色觀察，選出組織學形態(tài)較好的切片進行研究. 收集同時期意外死亡

9、健康成年男性正常肝臟組織標本10例，經(jīng)HE染色診斷為正常肝組織，作為對照組. 1.1.2試劑抗鼠抗人p57kip2 mAb（57P06），抗鼠抗人PCNA mAb（PC10），抗鼠抗人p53抗體（MAB0226），Elivision二步法檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司. 12方法 1.2.1p57kip2，PCNA，p53應用免疫組化(Elivision法)染色切片常規(guī)脫蠟至水，30 mL/L雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 min，將切片至于pH 6.0的檸檬酸緩沖液行高溫高壓抗原熱修復7 min，置冷，羊血清封閉37孵育20 min. 加p57kip2一抗（150），置于濕盒，4冰箱

10、過夜. PCNA和p53一抗均按150稀釋，置37恒溫箱孵育1 h. 先后加Elivision二步法檢測試劑盒中試劑A、B各50 L，分別室溫孵育40 min. DAB顯色，蘇木素襯染，鹽酸乙醇分化，脫水透明后中性樹膠封固. 光學顯微鏡下觀察結(jié)果. 以正常肝組織作p57kip2和p53的陽性對照，以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗作陰性對照. 以正常肝組織作PCNA的陰性對照. 1.2.2結(jié)果判定p57kip2蛋白以胞核或胞質(zhì)染色為棕黃色顆粒為陽性. 陽性細胞百分比為計400倍顯微鏡下10個視野陽性細胞的平均數(shù)：0，<10%；1，10%25%；2，25%50%；3，50%75%;

11、4，>75%. 陽性強度以著色程度進行計分: 0，不著色；1，淡黃；2，棕黃；3，棕褐. 兩分相乘: 02為陰性，35為弱陽性，68為陽性，912為強陽性. PCNA及p53以胞核染色為棕黃色顆粒>50%為陽性細胞. 統(tǒng)計學處理： 所得數(shù)據(jù)應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包處理. 采用Fisher確切概率法及Spearman相關(guān)分析. P<0.05認為有統(tǒng)計學意義. 2結(jié)果 2.1p57kip2的表達在32例原發(fā)性肝癌(HCC)組織中，p57kip2陽性表達18例，表達率56.25%，所有正常肝組織均為陽性表達（Fig 1），表達率為100%，肝癌組織p

12、57kip2的表達率顯著低于正常組織（P=0.011）. 表達p57kip2的高分化肝癌組織中，胞質(zhì)和胞核呈棕黃色顆粒(Fig 2). p57kip2在低分化肝癌組織中，與周圍陽性癌旁組織相比，癌灶陽性細胞著色淺，數(shù)量少，細胞排列不一，形態(tài)紊亂(Fig 3). 2.2p57kip2表達與肝癌的病理分級、臨床分期、及生存期等的關(guān)系p57kip2表達與肝癌的病理分級、臨床分期、及生存期有關(guān)，與年齡、AFP, 最大瘤徑及肝被膜轉(zhuǎn)移和局部侵犯無關(guān). 32例分化程度不同的肝癌標本中，癌細胞分化越差，p57kip2蛋白的表達率越低. p57kip2蛋白在級的陽性率（88.2%）顯著 級陽性率（20.0%,

13、 P=0.007）. p57kip2蛋白表達在早期HCC患者（72.2%）及生存期1 a的患者（78.6%）顯著高于晚期HCC患者（35.7%, P=0.041）及生存期1 a患者（27.8%, P=0.036）. 以血清甲胎蛋白(AFP)400 g/L為陽性標準，p57kip2蛋白在AFP陽性的HCC患者中表達率（36.4%）低于AFP陰性的HCC患者（66.7%），但統(tǒng)計學分析無顯著性差異（P=0.142）. p57kip2蛋白與腫瘤大小、年齡、肝被膜轉(zhuǎn)移和局部侵犯無統(tǒng)計學相關(guān)（P>0.05, Tab 1）.表1p57kip2與肝癌各項病理指標之間的關(guān)系（略） 2.3PCNA

14、和p53在肝癌組織中的表達癌巢中絕大多數(shù)癌細胞PCNA陽性，而癌旁組織陽性細胞數(shù)量很少（Fig 4）. p53在肝癌組織中的表達，陽性細胞核圓形，成棕黃色顆粒，大小不一（Fig 5）. 2.4肝癌組織中p57kip2和PCNA及與p53的表達的相關(guān)性PCNA與p57kip2的表達程度之間有顯著負相關(guān)性(rs=-0.397, P=0.025, Tab 2)，而p53與p57kip2的表達程度之間無顯著性相關(guān)(rs=0.197, P=0.279, Tab 2).表2p57kip2與PCNA，p53在原發(fā)性肝癌組織表達中的相關(guān)性（略） 3討論 細胞周期G1期的調(diào)控是有多種細胞周期調(diào)控因子參與的復雜過

15、程，細胞周期G1期調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)4. p57kip2基因定位于染色體11P11.5，編碼316個氨基酸殘基的多肽，Mr 57 000. p57kip2基因的表達產(chǎn)物屬于CIP/KIP家族與p21, p27部分同源，包含三個結(jié)構(gòu)域：一個與CDK抑制物p21及p27同源的N末端區(qū)域；一個中央脯氨酸富集域及一個與p27相同的C末端區(qū)（QT域）. 脯氨酸富集域含有一些PAPA重復序列（脯氨酸丙氨酸殘基組成），它們被認為可以介導特異的蛋白蛋白相互作用，從而實現(xiàn)p57kip2功能5, 6. 其抑癌機制是通過p57kip2蛋白與CyclinCDK復合物(ECDK2、D2CDK2和ACDK2

16、)結(jié)合，阻滯細胞增生，從而使細胞周期停滯在G1期而實現(xiàn)的7. 在眾多CDKIs中，只有p57kip2是胚胎形成所必需的，在增殖、運動、變形、分化等一系列復雜過程中都起重要作用8. p57kip2基因敲除的小鼠常出現(xiàn)臍疝、軟骨軟化缺陷、腎髓質(zhì)發(fā)育不良、腎上腺皮質(zhì)增生異常，腫瘤發(fā)生率增高；同時該類小鼠大多數(shù)在24 h死亡，僅有10%的小鼠存活，卻呈現(xiàn)嚴重的生長遲緩，提示p57kip2可能參與了細胞增殖和啟動細胞分化的作用9. p57kip2基因在正常人類是被印記的，這是第一個用該機制調(diào)控的細胞周期調(diào)控蛋白. 在正常情況下，p57kip2基因的父源基因被印記，母源基因表達. 在一些腫瘤中存在p57k

17、ip2基因印記缺失（Lose of Imprint）或印記錯誤，導致基因表達下降，導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展10. p57kip2作為腫瘤抑制因子和生長調(diào)控因子，它這種單個等位基因的表達方式增加了畸形和癌變的危險11. 現(xiàn)已證實p57kip2在食管癌、胃癌、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌等腫瘤組織均有表達12-14，但p57kip2表達與肝癌的關(guān)系報道較少. 本試驗結(jié)果表明，p57kip2在肝癌組織中的表達率明顯低于正常肝組織，并與組織分級、臨床分期及預后有關(guān)，提示p57kip2表達陰性者細胞增殖活性高，發(fā)展較快，預后較差. 證明了p57kip2有抑制腫瘤細胞增殖的作用. PCNA是DNA聚

18、合酶的輔助因子，不僅參與DNA的生物合成，而且與Cyclin, CDK, p21形成四聚體，調(diào)控細胞周期和細胞增殖. 其表達與細胞的增殖情況有關(guān)，因此可作為評價細胞增殖的指標15, 且PCNA的過度表達與消化系統(tǒng)腫瘤有關(guān). 本結(jié)果表明，PCNA在肝癌組織中的表達（56.2%）明顯高于正常組織（30.0%），且p57kip2在PCNA陽性的組織中表達明顯低于PCNA陰性者. PCNA與p57kip2的表達程度之間有顯著相關(guān)性(P<0.05). 說明p57kip2和PCNA可能存在協(xié)同作用，通過對PCNA的抑制，阻滯正在進行DNA復制的細胞進行進一步的DNA復制，從而實現(xiàn)抑癌作用.

19、p53是重要的凋亡活化基因. p53基因的突變，導致細胞周期監(jiān)控機制的破壞，人類50%的腫瘤都是由于p53基因突變，使DNA監(jiān)測點異常，導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展16. 但DNA損傷的監(jiān)測還存在非p53依賴機制17. 本結(jié)果表明，p53在肝癌組織中的表達率（46.9%）明顯低于正常組織（80%）；p57kip2陽性的肝癌組織中，p53的陽性率也高，但p53與p57kip2的表達程度之間無顯著性相關(guān)(P>0.05). 這恰恰說明p57可能是通過p53非依賴性機制，直接與CDKCyclins復合物結(jié)合，抑制它們激活參與細胞的增殖和凋亡調(diào)控，而不是像p21那樣通過p53p21CDKsCycli

20、ns途徑阻滯細胞周期. 綜上所述，p57kip2蛋白的缺失及PCNA的高表達有助于肝癌的發(fā)生、發(fā)展，而p57kip2與p53可能通過不同的途徑發(fā)揮細胞周期調(diào)控作用. 【參考文獻】 1 Matsuoka S, Edwards MC, Bai C, et al. p57KIP2, a structurally distinct member of the P21cipl CDK inhibitor family, is a candi2 date tumor suppressor gene1J. Gene Dev, 1995; 9(6):650. 2 Yue H, Na YL, Feng XL,

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