導(dǎo)向性IFNα2aαMSH基因的克隆、表達(dá)、純化及鑒定

1、導(dǎo)向性IFN2aMSH基因的克隆、表達(dá)、純化及鑒定【關(guān)鍵詞】 干擾素2a；促黑素；大腸桿菌；基因表達(dá)；pET22b(+)載體IFN2a是一種具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子，已被FDA批準(zhǔn)用于多種惡性腫瘤的治療，但因其在臨床治療中需大劑量長(zhǎng)期給藥且常會(huì)引發(fā)明顯的毒副作用，使其應(yīng)用受到一定的限制. MSH是一種由多種細(xì)胞分泌的含13肽的激素，也是一種天然存在的多肽，目前的研究證實(shí)其可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移1-2. Froidevanx等3研究表明所有黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞都表達(dá)MSH受體MC1R，且黑素瘤細(xì)胞表達(dá)MC1R上調(diào)，人黑素瘤細(xì)胞表面MC1R密度為9005700結(jié)合

2、位點(diǎn)/細(xì)胞，而正常狀態(tài)下人表皮黑素細(xì)胞上MC1R不超過(guò)100個(gè)結(jié)合位點(diǎn)/細(xì)胞. 我們利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建導(dǎo)向性IFN2aMSH融合基因表達(dá)載體，并誘導(dǎo)其在大腸桿菌中表達(dá)，旨在為惡性黑色素瘤的靶向性治療提供基礎(chǔ)資料.1材料和方法1.1材料1 / 14質(zhì)粒pET22b(+)、菌種DH5及RosettagamiTM2(DE3)，藥學(xué)系生物技術(shù)中心保存；各種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA 連接酶以及DNA Marker DL2000（TaKaRa公司）；片段合成與序列測(cè)定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成；DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒（Omega公司）；低Mr蛋白標(biāo)準(zhǔn)（MBI公司）；鼠抗人干擾素（S

3、anta Cruz公司）；羊抗鼠IgGAp（華美工程公司）：顯色劑（美國(guó)Promega公司）；蛋白胨、酵母粉、低熔點(diǎn)瓊脂糖（Spanish公司）；異丙基硫代D半乳糖苷（IPTG，華美生物工程公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2方法1.2.1IFN2aMSH融合基因的克隆按照大腸桿菌慣用密碼子設(shè)計(jì)并合成了編碼MSH導(dǎo)向肽的核苷酸片段：片段1（48 nt）：5 GAT CCTCCT ACT CCA TGG AAC ACT TCC GTT GGG GTA AAC CGG TTT AGG3；片段2（48 nt）：5 TCG ACC TAA ACC GGT TTA CCC CAA CGG AAG TG

4、T TCC ATG GAG TAG GAG3. 這兩個(gè)片段退火后可形成MSH導(dǎo)向肽的核苷酸片段以及5端和3端的粘性末端（BamH I和SalI的酶切位點(diǎn)）； 將合成的兩個(gè)片段煮沸變性10 min后退火，再與用BamHI和SalI雙酶切處理過(guò)的pET22b（+）IFN2aNGR質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5，培養(yǎng)篩選陽(yáng)性克隆(圖1).1.2.2重組質(zhì)粒的酶切和測(cè)序從抗生素瓊脂培養(yǎng)平板中挑取mAb抗性菌落，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶Nde和Nco進(jìn)行雙酶切鑒定及核酸序列分析. 將測(cè)序正確者命名為pET22b（+）IFN2aMSH.1.2.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)重組

5、質(zhì)粒pET22b(+)IFN2aMSH轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞RosettagamiTM2(DE3)，挑取mAb接種于含氨芐青霉素（50 mg/L）、四環(huán)素（25 mg/L）、鏈霉素（10 mg/L）及氯霉素（35 mg/L）的LB培養(yǎng)基中，次日清晨按1100的比例接種于上述同樣條件的LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至A600 nm=0.40.6時(shí)加入IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，37振蕩培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，行SDSPAGE鑒定.1.2.4IFN2aMSH的初步純化和Western Blot鑒定1.2.4.1超聲裂菌重組蛋白IFN2aMSH是以包涵體的形式存在，取5 g表達(dá)濕菌，將其懸浮于35

6、 mL STE(100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris.Cl, PH 8.0, 1 mmol/L EDTA)中，在冰浴中300 W超聲裂菌，超聲5 s，間歇10 s，全程20 min，4, 10 000 g離心20 min，保留上清，行SDSPAGE鑒定，并與溶菌酶裂菌結(jié)果進(jìn)行比較.1.2.4.2疏水作用層析初步純化重組蛋白層析柱為Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(high sub)；緩沖液A：25 mmol/L Tris.Hcl, 1 mmol/LEDTA, 1 mol/L (NH4)2SO4, pH 7.5；緩沖液B: 25 mmol/L T

7、ris.Hcl,1 mmol/L EDTA, pH 7.5；將超聲裂菌上清在冰浴中進(jìn)行硫酸銨沉淀，硫酸銨的終濃度為400 g/L, 4, 10 000 g離心20 min，保留沉淀，用約20倍體積的A液溶解沉淀，4，10 000 g離心20 min，保留上清備用. 層析柱以緩沖液A平衡至基線穩(wěn)定，上樣后繼續(xù)以緩沖液A沖洗至基線穩(wěn)定，線性梯度洗脫100% A至100% B,洗脫體積為約25個(gè)柱床體積，流速為3 mL/min.1.2.4.3Western Blot于SDSPAGE結(jié)束后拆下凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用鼠抗人IFN mAb（1100），行Western Blot鑒定.1.2.

8、4.4蛋白質(zhì)含量及活性測(cè)定將WISH細(xì)胞在含抗生素、谷氨酰胺和100 g/L FCS（pH 7.4）的Eagles培養(yǎng)液中37培養(yǎng)過(guò)夜. 待細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)后棄培養(yǎng)液，并用胰酶消化細(xì)胞. 將消化的WISH細(xì)胞按1000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板. 37孵箱培養(yǎng)過(guò)夜. 換為含50 g/L FCS的Eagles液稀釋的不同濃度的待測(cè)樣品，繼續(xù)培養(yǎng)，次日換用含50 g/L FCS的Eagles培養(yǎng)液按11030稀釋的VSV病毒培養(yǎng)液，37培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，以50%細(xì)胞保護(hù)的待測(cè)樣品稀釋度為其效價(jià).2結(jié)果2.1IFN2aMSH的酶切鑒定用限制性內(nèi)切酶Nde和Nco對(duì)重組質(zhì)粒pET22b(+)IFN2

9、aMSH進(jìn)行雙酶切，可見一約530 bp片段，與預(yù)期大小一致，證明目的片段已插入pET22b(+)載體中（圖2）. 測(cè)序結(jié)果與合成的MSH基因序列比對(duì)完全一致.2.2IFN2aMSH在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)SDSPAGE電泳結(jié)果表明，含有pET22b(+)IFN2aMSH的工程菌RosettagamiTM2(DE3)經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后在約20 ku處產(chǎn)生了一條新生蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合；而未誘導(dǎo)的則無(wú)相應(yīng)蛋白條帶出現(xiàn)（圖3）.2.3超聲裂菌及溶菌酶裂菌經(jīng)溶菌酶裂菌證實(shí)重組蛋白IFN2aMSH是以包涵體的形式存在，采用超聲裂菌的方法裂解菌體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在裂菌上清中出現(xiàn)IFN2aM

10、SH目的蛋白條帶（圖4）.2.4IFN2aMSH的純化和Western Blot鑒定采用疏水作用層析進(jìn)行重組蛋白的初步純化，可得到較高純度的IFN2aMSH（圖5），純化產(chǎn)物的Westernblot鑒定(圖6).2.5IFN2aMSH重組蛋白含量及活性的檢測(cè)溶菌酶裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活性分別為6.4×108 U/L, 4.176 g/L和1.536×108 U/g. 超聲裂菌上清的蛋白活性、蛋白含量及比活性分別為4×1011 U/L, 5.944 g/L和6.729×1010 U/g.3討論目前絕大多數(shù)的臨床藥物都存在一個(gè)不容忽視的缺陷，即缺

11、乏對(duì)病理部位的特異親和力. 大劑量給藥不僅使得藥物成本提高，還不可避免地產(chǎn)生非特異性毒性，對(duì)正常組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，引發(fā)毒副作用. 為了克服這一難題，人們提出了導(dǎo)向性的治療策略，我們實(shí)驗(yàn)室曾先后進(jìn)行了NGR導(dǎo)向性腫瘤治療藥物的研發(fā)，如IFN2aNGR，tum5 NGR4-5.IFN是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的基因工程產(chǎn)品，但在實(shí)體瘤的治療中，注射入體內(nèi)的IFN很少能達(dá)到腫瘤部位，因而治療效果較差1-2，MSH可與黑素瘤細(xì)胞表面的MC1R特異性結(jié)合，促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞的凋亡，并且通過(guò)皮膚基底膜的重建而抑制皮膚黑素瘤的轉(zhuǎn)移. Murata等6證實(shí)MSH在體內(nèi)外均可通過(guò)皮膚基底膜的重建抑制鼠B16細(xì)胞的侵襲

12、. 李蠡等7研究發(fā)現(xiàn)MSH可明顯上調(diào)惡性黑色素瘤細(xì)胞Fas/FasL的表達(dá)，促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞的凋亡.為了提高IFN2a對(duì)腫瘤組織的選擇性，我們通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建了融合表達(dá)載體pET22b(+)IFN2aMSH，并成功地在大腸桿菌中表達(dá)了融合蛋白IFN2aMSH，預(yù)期此種融合蛋白既具有與黑色素瘤特異性結(jié)合的能力，又具有IFN2a抗腫瘤活性，能提高治療作用，減低毒副反應(yīng).對(duì)于以包涵體形式存在的融合蛋白，由于包涵體結(jié)構(gòu)的特殊性，在用表面活性劑和變性劑處理、溶解包涵體時(shí)，會(huì)引起重組蛋白的變性. 我們通過(guò)簡(jiǎn)單的超聲裂菌使重組蛋白以可溶解的形式存在，避免了包涵體洗滌以及蛋白復(fù)性的過(guò)程，大大縮減了實(shí)驗(yàn)

13、的進(jìn)程，同時(shí)采用硫酸銨沉淀的方法，通過(guò)疏水作用層析一步分離得到較高純度的目的蛋白，可為今后對(duì)于以包涵體形式存在的融合蛋白的純化提供一個(gè)新的方法.【參考文獻(xiàn)】 1Zhu N, Lalla R, Eves P, et al. Melanoma cell migration is up regulated by tumour necrosis factoralpha and suppressed by alphamelanocytestimulating hormoneJ. Br J Cancer, 2004,90(7):1457-1463.2Eves P, Haycock J, Layton C,

14、 et al. Antiinflammatory and antiinvasive effects of alphamelanocytestimulating hormone in human melanoma cellJ.Br J Cancer, 2003,89(10):2004-2014. 3Froidevanx S, CalameChriste M, Tanner H, et al. A novel DOTAalphamelanocytestimulating hormone analog for metastatic melanoma diagnosisJ. J Nucl Med, 2002,43(12):1699-1706.4劉磊，孟潔如，趙寧，等. 融合蛋白IFN2aNGR在荷瘤小鼠體內(nèi)的腫瘤局部分布和組織定位J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004,25（15）:1400-1402.5Jieru M, Nan M, Zhen Y, et al. NGR enhanced the antiangiogenic activity of tum5J. J Biochem, 2006,140(2):1-6.6Murata J, Ayukawa K, Ogasawara M, et al. Alphamela