仙臺病毒載體對未成熟樹突狀細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

1、仙臺病毒載體對未成熟樹突狀細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 作者：易發(fā)平 張平波 郭風(fēng)勁 馬永平 宋方洲 【關(guān)鍵詞】 仙臺病毒載體；樹突狀細(xì)胞；蛋白質(zhì)組 【Abstract】 AIM： To investigate the protein changes in immature dendritic cells (DC) infected with sendai virus vector. METHODS: The total cellular proteins were collected and determined in the immature DC infected with sendai viru

2、s vector and the control ones uninfected with it. They were separated using 2dimensional gel electrophoresis (2DE) and visualized by silver staining. Digital images were analyzed by PDQuest software. The differentially expressed protein spots were picked and digested in gel, followed by identificati

3、on with peptide mass fingerprinting (PMF) using MALDITOF MS. RESULTS: More than 40 protein spots disappeared in 2DE of the treated group. Among them 5 protein spots that were apparently not expressed were identified by PMF. CONCLUSION: Protein expression decreased in DC infected with sendai virus ve

4、ctor. 【Keywords】 sendai virus vector; dendritic cell; proteomic 【摘要】 目的：研究仙臺病毒載體對未成熟樹突狀細(xì)胞（DC）蛋白質(zhì)表達(dá)的影響. 方法：提取轉(zhuǎn)染仙臺病毒載體的樹突狀細(xì)胞和對照細(xì)胞的總蛋白，定量. 雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)組分，膠體銀染顯色，PDQuest進(jìn)行圖像分析后選取差異點，膠內(nèi)酶解后MALDITOF MS進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定. 結(jié)果：圖像分析結(jié)果顯示，處理組2DE圖缺少了40個以上的蛋白點，對其中明顯沒有表達(dá)的5個蛋白點進(jìn)行了鑒定. 結(jié)論：仙臺病毒載體感染未成熟樹突狀細(xì)胞可引起蛋白表達(dá)的減少. 2 / 11【關(guān)鍵詞】

5、 仙臺病毒載體；樹突狀細(xì)胞；蛋白質(zhì)組 0引言 隨著人類基因組計劃的成功實施，各國科學(xué)家將生命科學(xué)的戰(zhàn)略重點轉(zhuǎn)到以闡明人類基因組整體功能為目標(biāo)的功能基因組學(xué)上. 蛋白質(zhì)作為生命活動的“執(zhí)行者”，自然成為新的研究焦點. 以二維電泳（2DE）為核心的蛋白分離技術(shù)和以質(zhì)譜方法為主的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)等技術(shù)體系已基本成熟. 樹突狀細(xì)胞（DC）是至今發(fā)現(xiàn)最強的抗原遞呈細(xì)胞，在國內(nèi)外都已將其作為腫瘤疫苗應(yīng)用于基因治療. 仙臺病毒載體是細(xì)胞質(zhì)型RNA載體，對各種動物細(xì)胞有較高的感染效率；它本身不進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行基因表達(dá)；在理論上不存在改變細(xì)胞核內(nèi)染色體的危險性，與以往的載體相比具有更高的安全性. 我們

6、通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法來研究仙臺病毒感染樹突狀細(xì)胞后蛋白表達(dá)變化，為聯(lián)合運用樹突狀細(xì)胞和仙臺病毒進(jìn)行基因治療方案的設(shè)計提供了實驗依據(jù). 1材料和方法 1.1材料C57BL/6小鼠，68周齡，雌性，由日本SLC株式公司培育. IPG膠條購于Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)，trypsin（測序級）購于Promega (Madison, WI, USA)， CHAPS，DTT，TEMED，BIS購于BIORAD，TFA購于Sigma，其余試劑采用國產(chǎn)分析純. 1.2方法參照文獻(xiàn)1方法培養(yǎng)C57BL/6小鼠來源的DC. 小鼠骨髓細(xì)胞，在含IL4 2

7、5 U/mL，GMCSF 250 U/mL的1640培養(yǎng)基中于37的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第4日更換一半培養(yǎng)基，第7日回收細(xì)胞. 每1×106細(xì)胞加100 L 1640培養(yǎng)基，感染仙臺病毒（感染重數(shù)，multiply of infection, moi=40），37 1 h，收集細(xì)胞. 用醋酸鎂緩沖液沖洗收集到的細(xì)胞數(shù)次，參照文獻(xiàn)2方法提取蛋白，并測定蛋白濃度，樣品于-70凍存?zhèn)溆? 雙向電泳參照Amersham公司技術(shù)手冊，18 cm pH 310膠條，上樣體積350 L，上樣量100 g，一向等電聚焦設(shè)置50 V 12 h；500 V 1 h；1000 V 1 h；4000 V 1

8、h；6000 V 1 h；8000 V 10 h. 膠條分別在含10 g/L DTT和40 g/L IAA的平衡液（50 mmol/L TrisHCl pH 8.8，6 mol/L 尿素、300 g/L甘油、20 g/L SDS）中平衡15 min后進(jìn)行第二向SDSPAGE電泳，300 g/L的丙烯酰胺，銀染法檢測蛋白. 重復(fù)3次. 染色后的雙向電泳凝膠照相后用PDQuest軟件（BioRad Laboratories, Hercules,CA）進(jìn)行圖像分析. 包括確定蛋白點的分子量、等電點和斑點匹配，切取重復(fù)性較好的差異蛋白點，經(jīng)過脫色、胰酶酶解、濃縮后進(jìn)行質(zhì)譜分析. 取1 L樣品于點樣盤，

9、加入等體積基質(zhì)，室溫干燥后用帶有PerSeptive Biosystem MALDITOF VoyagerDE RP Biospectrometry工作站（Applied Biosystems, Framingham, MA）的MALDITOF MS分析. 所得肽指紋圖譜用SWISSPROT.2005.01.06和NCBInr.2005.01.06數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索. 2結(jié)果 仙臺病毒感染未成熟DC后雙向電泳圖譜有差（圖1）. 與對照（未成熟DC全蛋白2DE圖譜）比較，通過PDQuest軟件分析發(fā)現(xiàn)，感染后的DC蛋白斑點明顯減少，達(dá)40個以上. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在Mr （3.06.6）×1

10、04，pI值主要分布于5.59.2間. 對其中明顯未表達(dá)的5個蛋白點作MALDITOF MS分析，得到圖2. 通過數(shù)據(jù)庫搜索，結(jié)合2DE圖譜上相應(yīng)蛋白質(zhì)的分子量、pI值，確定它們分別為小鼠鈣粒蛋白B，磷酸丙糖異構(gòu)酶，乳酸脫氫酶C鏈，鈣磷脂結(jié)合蛋白和白細(xì)胞介素11受體鏈（表1）. 圖1未成熟DC（A）和仙臺病毒載體轉(zhuǎn)染后的DC（B）的雙向電泳圖（略） 3討論 鈣粒蛋白B參與翻譯后調(diào)控，目前有關(guān)其功能的研究報道甚少. 鈣粒蛋白家族與一些腫瘤的發(fā)展相關(guān)，而且主要存在于胞漿中. 磷酸丙糖異構(gòu)酶存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中. 其功能是在糖酵解代謝途徑中催化磷酸二羥丙酮與3磷酸甘油醛之間的相互轉(zhuǎn)化，并在光合作用、糖

11、異生等代謝途徑中也催化同一反應(yīng). 已有大量的原細(xì)菌、真細(xì)菌和真核生物TIM 的研究報導(dǎo). 表1仙臺病毒載體轉(zhuǎn)染未成熟DC后差異蛋白鑒定結(jié)果（略） 乳酸脫氫酶也存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中. 其功能是在乳酸發(fā)酵過程中使丙酮酸還原成乳酸. 鈣磷脂結(jié)合蛋白是鈣磷脂結(jié)合蛋白超家族中的成員,作為表皮生長因子受體酪氨酸激酶的底物, 通過阻斷mRNA的合成而抑制磷脂酶A2的表達(dá). 具有多種生物學(xué)功能，并在多種腫瘤發(fā)生早期出現(xiàn)表達(dá)水平的改變,盡管目前具體的機制還不清楚,但它為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、早期診斷、治療提供了新的線索. 白細(xì)胞介素11 由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，分子質(zhì)量約為Mr 2.3×104，是造血微環(huán)境

12、中一個多功能的調(diào)節(jié)因子. 其受體是一種膜蛋白. 上述5種蛋白在仙臺病毒載體感染后的DC中明顯沒有表達(dá)，而通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)的未成熟DC中許多蛋白表達(dá)是明顯上調(diào)的3，包佳玲等用結(jié)核分枝桿菌感染人源DC也發(fā)現(xiàn)有4種蛋白是明顯上調(diào)的4. 這可能是因為仙臺病毒的的遺傳物質(zhì)是RNA，只在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，因此抑制了存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白表達(dá). 我們用敲出了仙臺病毒復(fù)制序列后來感染未成熟DC的蛋白分析中也證實了這一點，以后將陸續(xù)報道. 最近，Sandra等5也發(fā)現(xiàn)用不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)DC，其蛋白表達(dá)差異很大. 圖2蛋白點2(A)，3(B)和5(C)的肽指紋圖譜（略） 致謝日本九州大學(xué)張玲博士對本實驗細(xì)胞培養(yǎng)部分提

13、供了大力幫助，特此致謝. 【參考文獻(xiàn)】 1 蔡莉，惠延年，王琳，等. TGF2對樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003, 24（13）：1156-1158. 2 Zhang PB, Kohji Y, Yoich A, et al. Proteomic Studies of Isoforms of the P25 Component of Bombyx mori Fibroin J. Biosc, Biotechno, Biochem, 2005, 69(11):2086-2093. 3 Tang Z, Saltzman A. Understanding human dendritic cell biology through gene profilingJ. Inflamm Res, 2004, 53:424-441. 4 包佳玲，樂軍，田野蘋，等. 結(jié)核分枝桿菌感染人源樹突狀細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜J. 微生物學(xué)報，2005, 45（3）：415-419. 5 Sandra RP, Vitor MF, Glauce GG, et al. Changes in the proteomic prof