抗CD3單鏈抗體基因克隆表達(dá)及生物活性鑒定

1、抗CD3單鏈抗體基因克隆表達(dá)及生物活性鑒定 【關(guān)鍵詞】 單鏈抗體 【關(guān)鍵詞】 CD3分子； 單鏈抗體 【Abstract】 The genes encoding antibody heavy and light chain variable regions (VH and VL) were cloned by RTPCR from OKT3 hybridoma cells, which produced antiCD3 moleclonal antibody. The VH and VL genes were fused and become a single chain Fv (scFv).

2、 The scFv gene was cloned into pCANTAB5E vector and expressed on bacterial phage surface. By three panning rounds, we have obtained two singlechain antibodys that specific for CD3. The antiCD3 scFv will be a reagent for diagnosis and therapy of immunodisorder 1 實(shí)驗(yàn)資料 雜交瘤細(xì)胞OKT3來自ATCC.質(zhì)粒 pCANTAB5E，大腸桿菌

3、TG1和HB2151，內(nèi)切酶SfiI和NotI, 可變區(qū)引物均購(gòu)自Pharmacia公司.Taq DNA聚合酶，mRNA磁性分離試劑盒購(gòu)自Promega公司.以分泌抗CD3單克隆抗體的鼠雜交瘤細(xì)胞OKT3為原始材料，采用Promega公司試劑盒，從大約107細(xì)胞中分離和純化mRNA，合成cDNA第一鏈.通過RTPCR分別擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因. 為了加強(qiáng)抗體輕、重鏈可變區(qū)（Fv）的穩(wěn)定性和更好地維持抗體分子內(nèi)結(jié)合抗原區(qū)的空間構(gòu)象，在VH和VL基因之間用一段編碼(Gly4Ser)3的DNA序列把二者連接起來, 構(gòu)成抗體可變區(qū)單鏈融合基因.為了把單鏈抗體基因插入pCANT

4、AB5E 質(zhì)粒，我們以單鏈抗體基因?yàn)槟０?，引入一?duì)含SfiI和 NotI 酶切位點(diǎn)的引物， 再次 PCR 擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物Mr約720，基因大小與預(yù)測(cè)的單鏈抗體基因相符合（圖1）.把單鏈抗體基因插入到表達(dá)載體pCANTAB5E所含的噬菌體外殼蛋白g3p基因中. 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞后，在輔助噬菌體M13K07的作用下，單鏈抗體和外殼蛋白g3p以融合蛋白的形式表達(dá)于噬菌體的表面，形成一個(gè)抗CD3單鏈抗體文庫.以外周血單核細(xì)胞為抗原，用ELISA方法鑒定噬菌體抗體的免疫活性.首先用細(xì)胞分離液分離外周血T細(xì)胞，然后包被在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的96孔酶聯(lián)板上.分別與重組噬菌體抗體溫育1 h,用PB

5、S淋洗3次后，加入HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體抗體溫育1 h, 再用PBS淋洗3次，加入底物進(jìn)行顏色反應(yīng).用酶標(biāo)儀在490nm處檢測(cè)每孔的吸收值.挑選陽性克隆，感染大腸桿菌，獲得培養(yǎng)上清，再進(jìn)行免疫活性鑒定.經(jīng)過三輪親合感染擴(kuò)增的免疫篩選過程，使CD3重組噬菌體抗體得到富極. 隨機(jī)挑選12個(gè)重組噬菌體抗體克隆進(jìn)行ELISA檢測(cè).從中選出免疫活性最強(qiáng)的兩株陽性克隆.把這兩株陽性克隆的基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌HB2151，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可在上清中收集可容性單鏈抗體.ELISA進(jìn)一步證明該抗體能夠特異識(shí)別外周血單核細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞性白血病細(xì)胞，而不結(jié)合黑色素瘤細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞(圖2).說明單鏈抗體

6、保留了原單克隆抗體的抗原特異性. 2 / 71:1 kb標(biāo)準(zhǔn)分子量；2:抗體VL基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：重組質(zhì)粒經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切，鑒定VL基因；4：抗體VH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5：重組質(zhì)粒經(jīng)Xho和Hind雙酶切，鑒定VH基因. 圖1 瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物和重組載體酶切產(chǎn)物鑒定（略） 可溶性單鏈抗體結(jié)合外周血單核細(xì)胞（PBC）和淋巴母細(xì)胞性白血病細(xì)胞（MOLT4），但不結(jié)合黑色素瘤細(xì)胞（A375）和人宮頸癌細(xì)胞（Hela）. 圖2 ELISA檢測(cè)單鏈抗體免疫活性（略） 2 討論 單鏈抗體被認(rèn)為是具有抗原結(jié)合能力的最小功能單位1.它在某些應(yīng)用方面比完整抗體具有更多的優(yōu)越性，如免疫

7、原性較小，組織滲透性好, 在組織和血液中的清除率快，容易與其他功能分子重組，形成多功能抗體2-4.另外，單鏈抗體能夠在原核系統(tǒng)中高效表達(dá)，有利于大批量生產(chǎn).CD3分子是T淋巴細(xì)胞膜上特有的重要信號(hào)分子之一 5，6.抗CD3單鏈抗體與其他功能分子結(jié)合所形成的雙功能抗體在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤治療方面以顯示出良好的應(yīng)用前景7，8.我們構(gòu)建了抗CD3單鏈抗體基因，利用噬菌體展示技術(shù)表達(dá)單鏈抗體，通過免疫篩選，獲得CD3特異基因工程抗體.該抗體為雙功能抗體和重組免疫毒素的研制打下了基礎(chǔ). 【參考文獻(xiàn)】 Kuroki M, Arakawa F, Khare PD, Kuroki M, Liao S, Matsu

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