戊四氮誘導(dǎo)單次驚厥幼鼠海馬堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的研究

1、戊四氮誘導(dǎo)單次驚厥幼鼠海馬堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)的研究【摘要】 目的 利用戊四氮單次驚厥幼鼠模型，研究癲疒間單次驚厥發(fā)作后海馬各區(qū)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)情況。方法 建立戊四氮腹腔注射幼鼠單次驚厥發(fā)作模型，分成A組（癲疒間發(fā)作組）和B組(生理鹽水對(duì)照組）。每個(gè)組后按造模后1天、7天、14天分為3組。HE染色觀察病理形態(tài)改變，免疫組化觀察海馬bFGF表達(dá)變化。結(jié)果 病理形態(tài)上A組可見海馬神經(jīng)元變性、壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生，B組形態(tài)學(xué)無(wú)明顯變化。 bFGF表達(dá)：A組發(fā)作后1天bFGF表達(dá)增高最明顯(P<0.01)，以CA1區(qū)和齒狀回明顯，以后逐漸下降，7天時(shí)仍高于B組(

2、P<0.05)，14天時(shí)下降到較低水平，和B組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。B組各時(shí)間點(diǎn)bFGF表達(dá)無(wú)顯著性差異。 結(jié)論 幼鼠單次驚厥發(fā)作后海馬bFGF表達(dá)增加，在發(fā)作后7天內(nèi)較為明顯。bFGF在癲疒間后腦損傷的自我修復(fù)中可能發(fā)揮著重要的作用。 【關(guān)鍵詞】 癲疒間 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 海馬 Abstract： Objective To study the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) in the hippocampus of epileptic pedo-rats at differen

3、t time points and investigate its bearing on epilepsy. Methods Forty-two 14-day old SD pedo-rats were randomly divided into two groups: A (epilepsy model group) and B (normal saline group). Pentetrazole was used to induce seizure models. The expression of bFGF in the hippocampus of rats was studied

4、by immunofluorescent labeling technique. H-E staining was done for pathomorphological study. Results In group A， neuronal degeneration and necrosis in the hippocampus， and cellular proliferation of glial cells as well， were noticed; the expression of bFGF was increased， most marked 1 day after seizu

5、re (P<0.01)， continued to be higher for 7 days (P<0.05)， and then declined and approached the control level 14 days later (P>0.05). Conclusion The expression of bFGF in hippocampus of 14-day rat is increased after acute epilepsy， significantly higher for 7 days after seizure. bF

6、GF may play an important role in the self-plerosis after brain injury induced by epilepsy in pedo-rats. 2 / 14 Key words: epilepsy; basic fibroblast growth factor; hippocampus 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種具有多種生物活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，廣泛存在于外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)， 它在大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、小腦等多種組織均有表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞有明顯的營(yíng)

7、養(yǎng)和保護(hù)作用，能夠維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭受損傷后，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元高度表達(dá)bFGF，以維持神經(jīng)元的存活和促進(jìn)損傷神經(jīng)元的修復(fù)1-2。癲疒間發(fā)作也能誘導(dǎo)內(nèi)源性bFGF在選擇性腦區(qū)表達(dá)增高3，但不同發(fā)作類型表達(dá)特點(diǎn)并不相同。臨床上兒童癲疒間發(fā)病率遠(yuǎn)高于成人，但現(xiàn)有文獻(xiàn)很少涉及發(fā)育大鼠癲疒間后大腦bFGF表達(dá)情況。本文主要研究幼鼠單次驚厥后各時(shí)間點(diǎn)bFGF在海馬的表達(dá)分布情況，初步探討bFGF和未成熟腦癲疒間的關(guān)系。 1 資料和方法 1.1 動(dòng)物及分組 42只14天SD大鼠，雌雄不限，體重2538 g，隨機(jī)分為:A組:癲疒間發(fā)作組(n=24)和B組:生理鹽水對(duì)照組(n=18

8、)， 每個(gè)組按造模后1天、7天、14天分為3組，A組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=8，B組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=6。 1.2 癲疒間動(dòng)物模型的建立 A組給予大鼠腹腔注射戊四氮60 mg/kg，逐個(gè)動(dòng)物觀察記錄，行為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)4分為5級(jí)。選擇V級(jí)單次發(fā)作者（發(fā)作不超過30 min）作為癲疒間研究模型。B組同時(shí)給予等體積生理鹽水腹腔注射。 1.3 灌注和取材 10%水合氯醛(0.35 ml/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后剪開胸腹腔，暴露心臟和肝臟，用灌注針自心尖向上45度進(jìn)針至主動(dòng)脈起始段，剪破右心耳，先快速灌注生理鹽水，接著用4%多聚甲醛先快速滴注，然后緩慢滴注直至大鼠四肢強(qiáng)直，肝臟變白后停止灌注

9、，拔出穿刺針，剪開顱骨，取嗅腦至中腦之間的腦組織，放入4%多聚甲醛固定12 h以上，然后進(jìn)行石蠟包埋，切片取海馬組織冠狀位片，片厚67 m，每只大鼠取不連續(xù)部位腦片810張，分別進(jìn)行HE染色和免疫組化觀察。 1.4 免疫組化 采用兩步法免疫組化方法，試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司，一抗為1100兔抗大鼠bFGF多克隆抗體，陰性對(duì)照用PBS取代一抗，顯色劑用DAB和H2O2進(jìn)行著色，操作步驟按試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行，陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕褐色。 1.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 切片置于Olympus PM-CB顯微鏡下觀察，在高倍鏡下每張切片按齒狀回、CA1、CA3區(qū)任選3個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均

10、數(shù)。數(shù)據(jù)由SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行分析。P<0.05為差異有顯著性。 2 結(jié) 果 2.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察 A組：注射戊四氮后12 min進(jìn)入潛伏期，大鼠由自由活動(dòng)狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為安靜或伏臥，隨后出現(xiàn)眼神呆滯，頭面部肌肉輕微抽搐，出現(xiàn)濕狗樣抖動(dòng)并伴有須動(dòng)、耳抖和搔抓動(dòng)作，繼而進(jìn)入大發(fā)作期，漸次出現(xiàn)前肢陣攣、奔跑跳躍、后肢站立伴頭偏向一側(cè)及全身陣發(fā)性抽動(dòng);達(dá)到V級(jí)發(fā)作的動(dòng)物則表現(xiàn)為摔倒、翻滾等全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作，同時(shí)伴有喉鳴、口角流涎、肢端青紫等。整個(gè)發(fā)作持續(xù)約14 min后逐漸緩解

11、， 若出現(xiàn)連續(xù)多次發(fā)作則被剔除。B組:注射生理鹽水后無(wú)任何發(fā)作跡象和抽搐表現(xiàn)，行為正常。 2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察 B組海馬錐體細(xì)胞排列緊密、層次分明，細(xì)胞呈圓形或橢圓型，染色質(zhì)在核內(nèi)分布均勻，核仁清晰。A組1天：海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列逐漸散亂，細(xì)胞腫脹，繼之出現(xiàn)核固縮濃染、染色質(zhì)濃集、細(xì)胞變小、細(xì)胞外出現(xiàn)空暈等改變。A組7天：細(xì)胞排列散亂和細(xì)胞腫脹現(xiàn)象減輕，仍可見散在細(xì)胞胞質(zhì)濃縮，并有少許鬼影細(xì)胞。A組14天：變性的神經(jīng)細(xì)胞變?yōu)闄E圓形或三角形，周圍有小膠質(zhì)細(xì)胞增生。 2.3 免疫組化結(jié)果 A組bFGF陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)、胞核均有著色，胞核更為明顯，呈圓形、橢圓形。造模后1天bFGF表達(dá)在齒狀回、C

12、A1和CA3區(qū)均顯著增高(P<0.01)，發(fā)作后7天有所下降，但仍高于B組(P<0.05)，發(fā)作后14天bFGF表達(dá)下降，和B組無(wú)顯著性差異(P>0.05)（見表1，圖1）。A組bFGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)增加以CA1區(qū)最明顯，齒狀回和CA3區(qū)次之。B組各時(shí)間點(diǎn)海馬bFGF表達(dá)一直維持在較低水平，且陽(yáng)性細(xì)胞著色較淡。表1 14天大鼠海馬不同部位bFGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 3 討 論 bFGF是由154個(gè)氨基酸組成的多肽類生長(zhǎng)因子，被認(rèn)為是一種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有效的有絲分裂原，在正常腦組織， bFGF主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)核內(nèi)。在海馬中，研究發(fā)現(xiàn)bFGF主要定位于

13、CA1區(qū)神經(jīng)元。在正常狀態(tài)下，海馬有一定的bFGF基礎(chǔ)表達(dá)，這對(duì)維持海馬的正常功能是必需的， 有研究表明，缺血性腦梗死1和腦外傷2可誘導(dǎo)內(nèi)源性bFGF表達(dá)增加，側(cè)腦室注射外源性bFGF能減少癲疒間大鼠海馬神經(jīng)元的丟失，減輕海馬損傷，促進(jìn)行為恢復(fù)5。 癲疒間發(fā)作后海馬的bFGF表達(dá)在急性癲疒間和慢性癲疒間并不相同。研究發(fā)現(xiàn)點(diǎn)燃模型癲疒間大鼠腦內(nèi)bFGF和bFGFmRNA水平在發(fā)作后15天內(nèi)逐漸增高6，張廣慧等3發(fā)現(xiàn)氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)成年急性癲疒間大鼠bFGF表達(dá)增高以發(fā)作后1天最為明顯，以后逐漸下降，但在發(fā)作后14天仍然維持了較高的水平。本實(shí)驗(yàn)幼鼠單次驚厥海馬bFGF表達(dá)亦以發(fā)作后1天為著，發(fā)

14、作后7天其水平仍較高，而在發(fā)作后14天bFGF表達(dá)已恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。由此看來(lái)，急性癲疒間只誘導(dǎo)bFGF短期表達(dá)，而慢性癲疒間則可誘導(dǎo)bFGF長(zhǎng)期表達(dá)，2者的機(jī)制可能不盡相同。此外不同癲疒間模型發(fā)作后海馬bFGF表達(dá)空間分布也不盡一致， Riva等7利用 （KA海人藻酸）模型發(fā)現(xiàn)急性癲疒間定位于齒狀回和 CA1 區(qū)，慢性癲疒間 bFGF 表達(dá)的長(zhǎng)期效應(yīng)在海馬的各個(gè)區(qū)都有反映，總的趨勢(shì)是隨時(shí)間表達(dá)不斷增高，但以 CA1 區(qū)最為明顯，其次是齒狀回。本實(shí)驗(yàn)bFGF的表達(dá)以CA1區(qū)和齒狀回明顯，這與HE病理染色海馬形態(tài)學(xué)損傷較明顯的部位是一致的。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠年齡的選擇基于人腦和大鼠腦發(fā)育程度的對(duì)應(yīng)關(guān)系

15、。普遍認(rèn)為:14天大鼠的腦發(fā)育程度與1歲兒童相當(dāng)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在急性癲疒間中，幼鼠海馬區(qū)的bFGF表達(dá)水平和時(shí)間和成年大鼠也不盡相同，大鼠出生14天內(nèi)腦內(nèi)bFGF較低，僅為成鼠的208，由此推測(cè)幼鼠腦內(nèi)bFGF受體亦可能未發(fā)育完全或受體數(shù)量相對(duì)少，從而導(dǎo)致急性驚厥后幼鼠海馬bFGF表達(dá)的水平可能相對(duì)偏低而表達(dá)持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短，總之這種差異的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。 癲疒間后海馬內(nèi)源性bFGF表達(dá)增高對(duì)腦損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制目前尚未完全闡明， 研究發(fā)現(xiàn)bFGF主要表達(dá)于對(duì)損傷比較敏感的星形膠質(zhì)細(xì)胞，故推測(cè)bFGF表達(dá)的早期升高是星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)損傷的保護(hù)性反應(yīng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)，阻止神經(jīng)

16、元的死亡。而在損傷的后期，bFGF則參與了癲疒間后的苔蘚纖維發(fā)芽（mossy fiber sprouting，MFS）、神經(jīng)發(fā)生和突觸重建等腦可塑性變化過程，對(duì)維持神經(jīng)元的存活與再生有重要的意義。有學(xué)者認(rèn)為bFGF是促進(jìn)MSF作用最強(qiáng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子9。bFGF 能保護(hù)谷氨酸對(duì)海馬、大腦皮層等部位的神經(jīng)元的興奮性損傷，顯著提高癲疒間模型海馬區(qū)移植細(xì)胞的存活率，促進(jìn)移植細(xì)胞的整合10，損傷刺激通過谷氨酸受體激活和加速鈣離子內(nèi)流機(jī)制誘導(dǎo)了bFGF基因及其受體在一些選擇性腦區(qū)的表達(dá)增強(qiáng)，表達(dá)產(chǎn)物然后與細(xì)胞表面特異性受體相結(jié)合，結(jié)果引起鈣離子依賴的谷氨酸受體表達(dá)下降和受體功能下調(diào)11。朱丹彤等12研究發(fā)

17、現(xiàn)進(jìn)行迷宮訓(xùn)練的點(diǎn)燃大鼠bFGF 表達(dá)增強(qiáng)，因而對(duì)于已經(jīng)受到損傷的癲疒間大鼠腦功能起到保護(hù)作用，認(rèn)為內(nèi)源性bFGF 的表達(dá)增加是對(duì)點(diǎn)燃大鼠記憶障礙的一種保護(hù)性反應(yīng)。 兒童癲疒間發(fā)病率高而死亡率較成人低，且兒童時(shí)期是認(rèn)知發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。很多實(shí)驗(yàn)研究表明未成熟大腦驚厥導(dǎo)致腦損傷后突觸重建、神經(jīng)發(fā)生和苔蘚纖維發(fā)芽等可塑性變化與成熟大腦不盡相同，各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在這些過程中所發(fā)揮的作用還待我們進(jìn)一步去研究。癲疒間發(fā)作后通過某些方法促進(jìn)患者內(nèi)源性bFGF合成或給予恰當(dāng)?shù)耐庠葱詁FGF治療可能對(duì)驚厥后的腦損傷有修復(fù)作用并且對(duì)受損的認(rèn)知功能起一定的保護(hù)作用。 【參考文獻(xiàn)】 1 張化彪，黎杏群.bFGF 和腦

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