結(jié)直腸腺癌組織Grp78表達(dá)及意義

1、結(jié)直腸腺癌組織Grp78表達(dá)及意義 作者：劉芳 邢曉明 李玉軍 趙潔 【摘要】 目的 研究葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Grp78）在結(jié)直腸腺癌組織中表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)PV法檢測(cè) 87例結(jié)直腸腺癌組織（其中18例同時(shí)具有腺瘤組織）及配對(duì)正常黏膜組織Grp78的表達(dá)。結(jié)果 結(jié)直腸腺癌組織Grp78蛋白表達(dá)水平顯著高于正常黏膜組織（Z=-8.140，P<0.05）, 18例腺瘤組織中Grp78蛋白表達(dá)水平高于正常黏膜組織而低于癌組織（2=34.111，q=3.748.24，P<0.05）。在結(jié)直腸腺癌組織中未發(fā)現(xiàn)性別、年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因

2、素與Grp78蛋白的表達(dá)有關(guān)（P>0.05）。結(jié)論 Grp78在正常黏膜組織、腺瘤組織、癌組織中的表達(dá)呈逐漸增高的趨勢(shì)，Grp78可能參與了結(jié)直腸腺癌的發(fā)生過程。 【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸腺癌；蛋白質(zhì)Grp78；免疫組織化學(xué) ABSTRACTObjective To study the expression of glucose-regulated protein 78 （Grp78） in human colorectal carcinoma and its relationship with clinical and pathological features. MethodsTh

3、e expression of Grp78 was detected by immunohistochemistry PV technique in 87 colorectal carcinoma specimens, of which, 18 showed adenoma simultaneously,and in matched-pair normal mucous membrane. Results The expression of Grp78 in the cancer tissue was significantly higher than that of the normal c

4、olorectal membrane （Z=-8.140,P<0.05）. The Grp78 expression in the 18 adenoma specimens was significantly higher than that of the normal membrane but lower than that of the cancer （2 / 132=34.111,q=3.74-8.24,P<0.05）. The expression of Grp78 was not associated with gender, age, extent of

5、 differentiation, and lymph node metastasis （P>0.05）.ConclusionThe expression of Grp78 protein shows a gradual increase tendency in the order of from normal tissue, adenoma to carcinoma. Grp78 is involved in the development of colorectal carcinoma. KEY WORDS Colorectal carcinoma; Protein; Grp

6、78; Immunohistochemistry 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 （Grp78）又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白 （Bip）, 是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白家族成員之一。Grp78的功能很多, 除作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)外,它還是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種應(yīng)激蛋白, 在低糖、低氧、低Ca2+等應(yīng)激狀態(tài)下大量表達(dá)以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定, 保護(hù)細(xì)胞1,2。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Grp78在多種腫瘤組織中呈高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生有關(guān)36。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了Grp78在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)情況，并探討了其與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系。 1 材料與方法 1.1 標(biāo)本 收集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2005年1月

7、2008年4月石蠟包埋結(jié)直腸腺癌組織及其配對(duì)正常黏膜組織87例，其中18例同時(shí)具有腺瘤組織。87例病人中男60例，女27例；年齡3878歲（60 歲者43例，60 歲者44例）。腫瘤直徑5 cm者57例，5 cm者30例。病理學(xué)類型均為腺癌，參照癌細(xì)胞分化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：低分化 （級(jí)）38例，中分化 （級(jí)）35例，高分化 （級(jí)）14例。病理切片證實(shí)無腸周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者50例,已發(fā)生轉(zhuǎn)移者37例。所有標(biāo)本均經(jīng)40 g/L中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 m厚連續(xù)切片。 1.2 檢測(cè)方法 采用免疫組織化學(xué)PV法，第一抗體為羊抗人Grp78（Santa-Cruz，sc-1051）多克隆抗體，工作濃度為1200

8、；第二抗體為兔抗羊IgG。嚴(yán)格按照說明書操作，用已知Grp78陽性乳癌組織作陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。 1.3 結(jié)果判斷 Grp78主要表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，細(xì)胞膜上也有少量表達(dá)，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。根據(jù)DAB顯色結(jié)果，由兩位病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下先后觀察，進(jìn)行染色強(qiáng)度以及染色細(xì)胞比例的評(píng)分。染色強(qiáng)度得分標(biāo)準(zhǔn)為：完全陰性者0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；陽性細(xì)胞百分比評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：5%者0分，5%24%者1分，25%49%者2分，50%74%者3分，75%者4分。Grp78的表達(dá)指數(shù)以染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×染色細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)表示7。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用配比（對(duì)）秩和檢驗(yàn)（兩樣本

9、Wilcoxon和多樣本Friedman法）來比較各組織之間Grp78表達(dá)水平的差異，多樣本之間的兩兩比較采用q檢驗(yàn)。結(jié)直腸腺癌病人不同性別、分化程度、浸潤(rùn)深度等與Grp78表達(dá)之間的關(guān)系采用兩個(gè)樣本的秩和檢驗(yàn)（兩樣本Mann-Whitney U法）。所有數(shù)據(jù)統(tǒng) 計(jì)均在SPSS 13.0軟件包上進(jìn)行。 2 結(jié) 果 2.1 各組織中Grp78的表達(dá) Grp78蛋白主要在癌細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)，在正常黏膜組織中也可見少量的表達(dá)，癌組織中其表達(dá)水平（9.47±0.75,n=87）顯著高于正常黏膜組織（0.78±2.47,n=87）（Z=-8.140，P<0.05）。腺瘤

10、組織中其表達(dá)水平（5.33±2.74,n=18）顯著高于正常黏膜組織（1.00±0.84,n=18）而低于癌組織（9.56±2.09,n=18）（2=34.111，q=3.748.24，P<0.05）。 2.2 Grp78 表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征關(guān)系 結(jié)直腸腺癌組織中Grp78的表達(dá)與病人的性別、年齡及腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分級(jí)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P>0.05）。見表1。表1 Grp78蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系（略） 3 討 論 由于血供不足及營(yíng)養(yǎng)條件差等原因，實(shí)體腫瘤內(nèi)存在低糖、低氧及酸中毒等應(yīng)激微環(huán)境,這

11、些病理?xiàng)l件均可引起 Grp78 的過度表達(dá)，誘導(dǎo)其表達(dá)可能是癌細(xì)胞在不利生存條件下的一種防御機(jī)制。作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種鈣結(jié)合蛋白，在應(yīng)激狀態(tài)下，Grp78可以直接抑制前凋亡組分的激活8； 還可以轉(zhuǎn)移內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集的大量的錯(cuò)誤折疊蛋白,維持細(xì)胞蛋白質(zhì)的繼續(xù)合成，從而維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣穩(wěn)態(tài)和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定9。大量研究表明，Grp78的這種抗凋亡和細(xì)胞保護(hù)作用與乳癌、肺癌、胃癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)36。 本研究結(jié)果顯示，在正常結(jié)直腸黏膜、腺瘤及癌組織中，Grp78的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢(shì)，表明Grp78在結(jié)直腸腺癌的發(fā)生中起一定的作用，提示它不僅可以作為一種新的標(biāo)志物指示結(jié)直腸腺癌的發(fā)生，也可以作為其治療的

12、靶點(diǎn)，為下一步的研究提供了方向。 RAUSCHERT 等10最新研究顯示，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)一種新型的相對(duì)分子質(zhì)量為82 000 的Grp78變異體，其抗原表位為惡性腫瘤細(xì)胞所特有，而且從胃癌病人中分離得到的IgM型單克隆抗體SAM-6可以與其特異性結(jié)合。此證據(jù)表明Grp78變異體可以引起機(jī)體免疫反應(yīng)，從而可以利用其作為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)。 SVETLANA 等11首次證實(shí)，綠茶中最有活性的抗癌成分EGCG通過與Grp78結(jié)合，使其由有活性的單聚體轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的二聚體或多聚體，阻止了Grp78與caspase-7的進(jìn)一步結(jié)合，從而抑制Grp78介導(dǎo)的抗凋亡作用及細(xì)胞保護(hù)作用，對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療可

13、以起到積極作用。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),大豆中的抗癌劑染料木黃酮 （genistein）可以抑制 Grp78及其他葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白和熱休克蛋白反應(yīng),從而抑制人類白血病細(xì)胞生長(zhǎng)12。還有研究表明，Grp78與腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的抗藥性有關(guān)，包括阿霉素和依托泊甙等，抑制其表達(dá)，可以增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性13，14。 本研究已證實(shí)Grp78在結(jié)直腸腺癌組織中呈過表達(dá), 并計(jì)劃在此基礎(chǔ)上通過RNA干擾方法抑制癌細(xì)胞中Grp78的表達(dá)，以期達(dá)到治療效果，為結(jié)直腸腺癌的基因治療提供新思路。然而，我們未發(fā)現(xiàn)Grp78的表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Grp78與結(jié)直腸腺癌的進(jìn)展

14、關(guān)系不大，此方面還有待于進(jìn)一步的研究。 【參考文獻(xiàn)】 1LEE A S. The glucose-regulated proteins: stress induction and clinical applications J. Trends Biochem Sci, 2001,26（8）:504-510. 2張紅,張睿,張小喬,等. 丹紅注射液對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元體外模擬缺血再灌注損傷的保護(hù)作用J. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008,44（3）:205-208. 3FU Y, LEE A S. Glucose regulated proteins in cancer progression, dr

15、ug resistance and immunotherapyJ. Cancer Biol Ther, 2006,5（7）:741-744. 4FERNANDEZ P M, TABBARA S O, JACOBS L K, et al. Overexpression of the glucose-regulated stress gene Grp78 in malignant but not benign human breast lesionsJ. Breast Cancer Res Treat, 2000,59（1）:15-26. 5URAMOTO H, SUGIO K, OYAMA T,

16、 et al. Expression of endoplasmic reticulum molecular chaperone Grp78 in human lung cancer and its clinical significanceJ. Lung Cancer, 2005,49（1）:55-62. 6SONG M S, PARK Y K, LEE J H, et al. Induction of glucose-regulated protein 78 by chronic hypoxia in human gastric tumor cells through a protein k

17、inase C-epsilon/ ERK/AP-1 signaling cascadeJ. Cancer Res, 2001,61（22）:8322-8330. 7XING X, LAI M, WANG Y, et al. Overexpression of glucose-regulated protein 78 in colon cancerJ. Clin Chim Acta, 2006,364（1-2）:308-315. 8RAO R V, CASTRO-OBREQON S, FRANKOWSKI H, et al. Coupling endoplasmic reticulum stre

18、ss to the cell death program. An Apaf-1-independent intrinsic pathwayJ. Biol Chem, 2002,277（24）:21836-21842. 9YU Z, LOU H, FU W, et al. The endoplasmic reticulum stress-responsive protein Grp78 protects neurons against excitotoxicity apoptosis: suppression of oxidative stress and stabilization calci

19、um homeostasis J. Exp Neurol, 1999,155（2）:302-314. 10RAUSCHERT N, BRANDLEIN S, HOLZINGER E, et al. A new tumor-specific variant of Grp78 as target for antibody-based therapyJ. Lab Invest, 2008,88（4）:375-386. 11SVETLANA P, ERMAKOVA KANG B S, CHOI BY, et al. （-）-Epigallocatechin gallate overcomes resistance to etoposide- induced cell death by targeting the molecular chaperone glucose-regulated protein 78