苦瓜蛋白抑制腫瘤基質(zhì)金屬蛋白酶的活性及表達

1、苦瓜蛋白抑制腫瘤基質(zhì)金屬蛋白酶的活性及表達 作者：熊術(shù)道，尹麗慧，李景榮，葉愛芳，章圣輝，溫博貴【摘要】 目的 探討苦瓜蛋白對H22荷瘤小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶表達及其活性的影響。方法 將清潔級ICR雄性小鼠隨機分成5組，建立肝癌H22移植瘤模型，分為陰性對照組、高劑量組(T3)、中劑量組(T2)、低劑量組(T1)及陽性對照組（CTX,環(huán)磷酰胺處理組）。在普通飼料飼喂的基礎(chǔ)上采用腹腔注射給藥法分別予陰性對照組生理鹽水；高、中、低劑量組分別給以不同劑量苦瓜蛋白；陽性對照組予環(huán)磷酰胺。觀察苦瓜蛋白對抑瘤率的影響，明膠酶譜法檢測荷瘤小鼠血清基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性及其變化。結(jié)果 苦瓜蛋白

2、組低、中、高劑量組及陽性對照組抑瘤率分別為52.05%、66.89%、85.81及65.10；各苦瓜蛋白干預(yù)組與陰性對照組相比，MMP-2、MMP-9的活性降低，酶原表達下調(diào)(P<0.01)，上述作用與苦瓜蛋白劑量相關(guān)。結(jié)論 苦瓜蛋白具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶表達及其活性的作用，其抗腫瘤作用可能與苦瓜蛋白具有抑制MMPs的活性及其表達有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 苦瓜蛋白移植性腫瘤抗腫瘤作用基質(zhì)金屬蛋白酶2 / 16Abstract: Purpose To explore effect of Momordin on expression and activity of matrix metal

3、loprotease in murine transplanted tumor(H22). Methods Male mice of ICR species were randomly divided into 5 groups and then constructed the transplantation tumor model of liver cancer H22. The negative control group were treated by normal saline; T1, T2 and T3 group by Momordin with low, middle and

4、high dose respectively and positive control group by cytoxan (CTX group). All the mice were feeded ordinarily with intraperitoneal drugs administration. Tumor inhibitive rate of Momordin was measured. Activity of MMP-2 and MMP-9 in serum was detected by Gelatin Zymography. Results Tumor inhibition r

5、ate in low, middle and high dose of Momordin and CTX group were 52.05%, 66.89%, 85.81% and 65.10%, respectively. The activity of MMP-2 and MMP-9 significantly decreased in all Momordin treated groups compared to the negative control group (P<0.01). The above function correlated to the dose of

6、 Momordin. Conclusion Momordin plays a role of inhibitory effect on the expression and activity of matrix metalloprotease and its anti-tumor activity may be involved in regulating the expression and activity of matrix metalloprotease. Key words: Momordin; transplanted tumor; anti-tumor activity; mat

7、rix metalloprotease. 苦瓜(momordica charantia) 屬葫蘆科植物，中醫(yī)認為其具有消暑滌熱、明目、解毒之功效?？喙系鞍?momordin)是從苦瓜籽中分離出來的一種分子量約為30kD的堿性糖蛋白質(zhì)，屬于型核糖體失活蛋白(ribosome inhibiting protein，RIP)。近年來研究表明RIP具有明顯的抗腫瘤、抗病毒作用，具有極高的藥用價值1，2。本文在前人分離純化RIP的工作基礎(chǔ)上，采用強陽離子交換層析SP Sepharose High Performance為分離介質(zhì)分離純化得到了苦瓜籽蛋白，我們前期的研究表明苦瓜RIP可以明顯誘導K562細

8、胞產(chǎn)生細胞凋亡3，4。為進一步研究苦瓜RIP對動物移植性腫瘤的作用（in vivo）的分子機制，我們研究了苦瓜蛋白對移植性肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤作用及基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制作用，以進一步闡明苦瓜蛋白抗腫瘤作用的機制，為促進苦瓜蛋白應(yīng)用于抗腫瘤治療提供理論和實驗基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 材 料 主要儀器：Image master凝膠成像系統(tǒng)（GE health），垂直電泳儀(Bio-Rad mini-protein)。 主要試劑：丙稀酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、過硫酸銨及TEMED等電泳試劑購置于上海生工生物工程有限公司。 實驗動物與細胞株：清潔級ICR雄性小鼠，體重18g22g，溫州醫(yī)學院實驗動

9、物中心提供。ICR小鼠H22腹水瘤細胞由浙江中醫(yī)學院生命科學系惠贈。 1.2 方 法 1.2.1 苦瓜蛋白分離與純化5 預(yù)冷梯度丙酮沉淀得到的苦瓜籽粗蛋白經(jīng)SP Sepharose High Performance 陽離子交換層析柱在GE-Health中壓層析系統(tǒng)中分離純化得到苦瓜蛋白。 1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立 無菌條件下抽取肝癌小鼠腹水中的H22細胞，用無菌生理鹽水將收集到的腫瘤細胞濃度調(diào)整為1×106/ml，于ICR小鼠左前肢腋下行無菌皮下接種，每只小鼠接種0.2ml細胞懸液，細胞總數(shù)為2×105。 1.2.3 實驗動物分組及處理 小鼠接種H22細胞后24h分組

10、（每組12只），隨機分為低劑量苦瓜蛋白給藥組（T1，25mg/kg），中劑量苦瓜蛋白給藥組(T2，50mg/kg)和高劑量苦瓜蛋白給藥組(T3，100mg/kg)；另設(shè)陰性對照組(con，給以等量生理鹽水)；陽性對照組（CTX，40mg/kg）。各組均腹腔注射給藥，給藥體積為每只0.2 ml，每天1次，連續(xù)12天。停藥后次日對小鼠進行眼靜脈穿刺取血，離心分離血清-20凍存?zhèn)溆谩?1.2.4 苦瓜蛋白對荷瘤小鼠腫瘤抑制作用 停藥后次日處死小鼠，剝離瘤體稱其質(zhì)量，計算腫瘤生長抑制率(抑瘤率)。抑瘤率=(對照組平均瘤重量-治療組平均瘤重量)×100對照組平均瘤重量。 1.2.5 MMP酶譜

11、檢測6 制備7.5丙稀酰胺凝膠（含0.1明膠），血清120稀釋后加入等量的無還原劑2×SDS上樣緩沖液，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后將膠置于2.5% Triton X-100溶液中室溫搖洗2次，每次15min；加入反應(yīng)液（50mM Tris-HCl (pH 7.5)，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.02%NaN3）37孵育過夜。取出凝膠進行考馬斯亮藍染色并脫色，結(jié)果用Iamgemaster進行拍照，結(jié)果分析采用Quantity one 軟件進行密度掃描分析。其中：MMP活性表現(xiàn)為深色背景中的白色或淺色條帶。其中相對分子量92kD為MMP-9酶原相應(yīng)條帶，84kD

12、為其活化形式；72kD為MMP-2酶原相應(yīng)條帶，64kD為其活化形式相應(yīng)的條帶，凝膠照相后進行灰度分析以估計各形式MMP的活性。 1.3 統(tǒng)計學處理 用One-way ANOVE 統(tǒng)計方法進行student t檢驗，P<0.05者即具有顯著性差異。 2 結(jié) 果 2.1 苦瓜蛋白對荷瘤小鼠腫瘤抑制作用的影響 不同劑量苦瓜蛋白及CTX對ICR小鼠H22實體瘤均有明顯抑制作用。25、50及100mg/kg苦瓜蛋白組抑制率分別為52.05%、66.89%及85.81；CTX陽性對照組腫瘤抑制率為65.10%，與陰性對照組比較差異有顯著性(P<001)（見表1）。 2.2 苦

13、瓜蛋白對荷瘤小鼠血清MMPs作用的影響 不同劑量苦瓜蛋白及CTX對H22荷瘤ICR小鼠血清MMPs酶原表達及活性均有明顯的下調(diào)作用（與陰性對照組比較，P<001）；不同劑量苦瓜蛋白組間差異有顯著性(P<0.05)，MMPs表達及活性下調(diào)與苦瓜蛋白處理的濃度的高低呈正相關(guān)，以高劑量組變化最明顯（見表1，圖1）。 3 討 論 近年來，從祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫中發(fā)掘的抗腫瘤藥物用于腫瘤治療已經(jīng)成為一個新的研究和發(fā)展方向，并在臨床應(yīng)用中取得了可喜進展。苦瓜作為藥食同源的植物，苦瓜蛋白藥理活性顯著，毒副作用小，具有抗腫瘤、抗病毒等作用。其中苦瓜蛋白屬于型核糖體失活蛋白，是從苦瓜種仁

14、中分離出來的一類能夠使核糖體失活、抑制細胞蛋白質(zhì)合成的堿性糖蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)某些植物來源的型RIP能夠誘導腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡13，而對正常的小鼠上皮培養(yǎng)細胞(Smac-13)無抑制作用7。另外，我們分離得到的苦瓜蛋白經(jīng)實驗證實可以明顯誘導K562細胞產(chǎn)生細胞凋亡3，同時細胞黏附分子CD54表達上調(diào)與苦瓜RIP誘導腫瘤細胞凋亡相關(guān)4。 MMPs 作為一組Zn2依賴性具有相關(guān)結(jié)構(gòu)的內(nèi)肽酶，可水解細胞外基質(zhì)。它們在生理狀態(tài)下主要參與組織發(fā)育、傷口愈合、骨生長及血管生成等參與組織的重建等。在病理情況下，MMPs則能促進許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，如參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移以及促進新生血管的形成等病理過程，在肝

15、癌等腫瘤中高表達MMP-2及MMP-9，因此阻斷細胞外基質(zhì)降解及抑制MMPs活性已逐漸成為腫瘤治療的新靶點8，9。本研究結(jié)果表明，苦瓜蛋白對小鼠移植性腫瘤H22的生長有顯著的抑制作用；苦瓜蛋白對MMP-2及MMP-9的酶原及其活性具有明顯的抑制作用，與苦瓜蛋白作用劑量呈正相關(guān)，其中，以MMP-9活性降低最為明顯。目前已知MMPs體內(nèi)的主要抑制物是組織抑制劑(TIMPs)，其中TIMP-2分布最為廣泛，不僅可以與已活化的多種MMPs結(jié)合并抑制其活性，還可與酶原結(jié)合，抑制酶原的活化10。另外，RECK ( reversion inducing cysteine rich protein with

16、kazalmotifs)基因是近年來發(fā)現(xiàn)的新型MMP抑制劑，可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制多種MMP的表達，從而抑制MMP參與的腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移和炎癥的進展6，11。因此，苦瓜蛋白可能通過通過上述機制來抑制MMPs的合成，特別可能是抑制其活性等機制來發(fā)揮抗腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移作用。但苦瓜蛋白抑制MMPs的具體機制尚需下一步研究加以證實。 綜上所述，苦瓜蛋白具有明顯抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性；其抗腫瘤作用可能和苦瓜蛋白具有抑制MMPs的活性及其表達等因素有關(guān)?！緟⒖嘉墨I】 1 Lee-Huang S, Huang PL, Sun Y, et al. Inhibition of MDA-MB-231 human

17、breast tumor xenogarfts and HER2 expression by antitumor agents GAP31 and MAP30J. Anticancer Res, 2000, 20(2A):653-659.2 郎海濱, 糜漫天, 程天民 苦瓜核糖體失活蛋白的純化及其誘導HL-60細胞凋亡的研究J 營養(yǎng)學報, 2004, 26(2):139-143.3 熊術(shù)道, 尹麗慧, 李景榮, 等. 苦瓜蛋白誘導K562細胞凋亡及其對Bcl-2、PCNA蛋白表達的影響J. 中國免疫學雜志, 2006, 22(11):1002-1005.4 熊術(shù)道, 尹麗慧, 李景榮, 等.

18、粘附分子CD54、CD44在苦瓜蛋白誘導K562細胞凋亡中的作用J. 中國臨床藥理學與治療學, 2005, 10（12）:1403-1407.5 Tsang KY, Ng TB. Isolation and characterization of a new ribosome inactivating protein momorgrosvin, from seeds of the monk's fruit Momordica grosvenoriiJ. Life Sci, 2001, 68(7):773-784. 6 Liu LT, Chang HC, Chiang LC, et al. Histone deacetylase inhibitor up-regulates RECK to inhibit MMP-2 activation and cancer cell invasionJ. Cancer Res, 2003, 63(12):3069-3072. 7 Ling J, Liu WY. Cytotoxicity of two new ribosome-inactivating protein, cinnamomin and camphorin, to carci