比色法和分光光度法

1、 一一. 概述概述 (1) 比色法和可見分光光度法的特點比色法和可見分光光度法的特點 比色法比色法: 在分析化學中在分析化學中, 利用比較利用比較 有色溶液顏色的深淺來測定物質含有色溶液顏色的深淺來測定物質含 量的分析方法稱為比色法。過去大量的分析方法稱為比色法。過去大 多用眼睛觀察比較多用眼睛觀察比較, 故又稱目視比故又稱目視比 色法。色法。 第二節(jié)第二節(jié) 比色法和可見分光光度法比色法和可見分光光度法光電比色法光電比色法(分光光度法分光光度法): 隨著近代分析儀器的發(fā)展隨著近代分析儀器的發(fā)展, 目前已目前已 普遍使用光電比色計普遍使用光電比色計(分光光度計分光光度計)通通 過測量有色溶液對入

2、色光的吸收程度過測量有色溶液對入色光的吸收程度 對物質進行分析對物質進行分析, 稱為光電比色法稱為光電比色法(分分 光光度法光光度法)。與目視比色法相比與目視比色法相比, 光度法的特點光度法的特點: 靈敏度高靈敏度高;10-5 10-6mol/L 準確度較高準確度較高; 儀器設備較簡單儀器設備較簡單, 操作簡便、操作簡便、 快速；快速； 應用廣泛。應用廣泛。(2) 光的性質和物質的顏色光的性質和物質的顏色 光的性質光的性質: 光是一種電磁波光是一種電磁波, 具具 有波粒二象性。光的波動性可用有波粒二象性。光的波動性可用波長來描述波長來描述, 其單位常用納米其單位常用納米(nm)表示表示, 波長

3、越短波長越短, 能量越高。能量越高。 具有同一波長的光稱為單色光具有同一波長的光稱為單色光,由不由不同波長光組成的光稱為復合光。同波長光組成的光稱為復合光。 互補色光互補色光: 若將兩種顏色的光按適當的若將兩種顏色的光按適當的 強度比混合可成白光強度比混合可成白光, 那么這兩種光稱為那么這兩種光稱為互補色光?；パa色光。物質的顏色物質的顏色: 物質對光的吸收是具有選擇性的。物質對光的吸收是具有選擇性的。 當一束白光通過溶液時當一束白光通過溶液時, 若溶液對各若溶液對各 種色光都不吸收種色光都不吸收, 則白光全部通過則白光全部通過, 溶液呈無色透明溶液呈無色透明; 若各種色光幾乎全若各種色光幾乎全

4、 被吸收被吸收, 則溶液呈黑色則溶液呈黑色; 若溶液只吸收若溶液只吸收 某種色光某種色光, 則溶液呈透過光的顏色則溶液呈透過光的顏色, 也也 就是說就是說, 溶液呈吸收光的互補色光的溶液呈吸收光的互補色光的 顏色。顏色。 例如例如, 白光通過白光通過CuSO4溶液時溶液時, 溶液溶液 顏色為藍色。顏色為藍色。 吸收曲線吸收曲線: 為了精確表明溶液對不為了精確表明溶液對不 同波長光的吸收情況同波長光的吸收情況, 可將不同波長可將不同波長 的單色光依次通過某一固定濃度的有的單色光依次通過某一固定濃度的有 色溶液色溶液, 測量該溶液對各單色光的吸測量該溶液對各單色光的吸 收程度收程度, 即吸光度即吸

5、光度, 以波長為橫坐標以波長為橫坐標, 吸光度為縱坐標作圖所得曲線吸光度為縱坐標作圖所得曲線, 即為即為 吸收曲線吸收曲線, 或稱吸收光譜?；蚍Q吸收光譜。二、朗伯二、朗伯-比爾定律比爾定律 (1) 朗伯朗伯-比爾定律比爾定律 透光度透光度(透光率透光率T):0tIIT 吸光度吸光度(A):0tlgIIA朗伯朗伯-比爾定律比爾定律:KbcIITAt0lglg 此式表明此式表明: 當一束平行的單色光通當一束平行的單色光通 過吸光物質的均勻溶液時過吸光物質的均勻溶液時, 溶液的吸溶液的吸 光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成 正比。正比。 K:比例常數比例常數, 與入射光

6、波長與入射光波長, 溶液溶液 中吸光物質的本性及溶液的溫度有中吸光物質的本性及溶液的溫度有 關。關。(2) 吸光系數吸光系數 當當b以以cm, c以以g/L為單位為單位, K為吸光為吸光 系數系數, 用符號用符號a表示表示, 單位為單位為L/g cm A=abc 當當b以以cm, c以以mol/L為單位時為單位時, K為為 摩爾吸光系數摩爾吸光系數, 用符號用符號表示表示, 單位單位 為為L/ mol cm A=bc a與與的關系的關系: Ma 比吸光系數比吸光系數( ): 指質量濃度指質量濃度為為 1%(g/mL), b為為1cm時的吸光度時的吸光度值值, 單位為單位為mL/g cm 同一物

7、質的同一物質的與與 之間的關系之間的關系:1%1cmE1%1cmEr1%1cm10ME 例例1 一含一含Fe2+濃度為濃度為0.5mg/L的溶的溶 液液, 用鄰二氮菲顯色測定用鄰二氮菲顯色測定, 吸收池厚吸收池厚 度為度為2cm,在在508nm處測得吸光度為處測得吸光度為 0.19, 求其摩爾吸光系數和比吸光系求其摩爾吸光系數和比吸光系 數。數。(3) 偏離朗伯偏離朗伯-比爾定律的原因比爾定律的原因 標準曲線標準曲線: 根據朗伯根據朗伯-比爾定律比爾定律,當當 吸收池厚度不變吸收池厚度不變, 以吸光度為縱坐以吸光度為縱坐 標標, 濃度為橫坐標作圖時濃度為橫坐標作圖時, 應得到一應得到一 條通過

8、原點的直線條通過原點的直線, 稱為校正曲線或稱為校正曲線或 標準曲線。標準曲線。偏離朗伯偏離朗伯-比爾定律的主要原因比爾定律的主要原因: 定律僅適用于稀溶液定律僅適用于稀溶液 化學變化引起的偏離化學變化引起的偏離(正偏離正偏離) 非單色入射光引起的偏離非單色入射光引起的偏離(負負 偏離偏離)三三. 方法和儀器方法和儀器 (1) 目視比色法目視比色法 目視比色法目視比色法: 用眼睛觀察比較溶液顏色深用眼睛觀察比較溶液顏色深度以測量物質含量的分析方法稱度以測量物質含量的分析方法稱為目視比色法。為目視比色法。標準系列法的原理標準系列法的原理: 朗伯朗伯-比爾定律對標準系列法原比爾定律對標準系列法原理

9、的解釋理的解釋: A=sbscs=xbxcx標準系列法的優(yōu)點標準系列法的優(yōu)點: 儀器簡單儀器簡單, 操作簡便操作簡便,適宜于大批適宜于大批 試樣分析試樣分析 適宜于稀溶液中微量組分的測定適宜于稀溶液中微量組分的測定 某些不完全符合朗伯某些不完全符合朗伯-比爾定律比爾定律 的顯色反應的顯色反應, 仍可用此法進行測仍可用此法進行測 定。定。標準系列法的缺點標準系列法的缺點: 準確度較差。準確度較差。(2) 光電比色法和可見分光光度法光電比色法和可見分光光度法 光電比色法的原理光電比色法的原理: 所用儀器為所用儀器為光電比色計。光電比色計。 光源光源濾光片濾光片一定波長范圍的一定波長范圍的近似單色光

10、近似單色光有色溶液有色溶液透過光透過光光電池光電池檢流計的標盤檢流計的標盤 可見分光光度法所用的儀器稱為可見分光光度法所用的儀器稱為 分光光度計分光光度計, 它是利用分光能力很強的它是利用分光能力很強的棱鏡或光柵的原理棱鏡或光柵的原理, 作為單色器作為單色器, 可連可連續(xù)獲得不同波長的單色光續(xù)獲得不同波長的單色光, 其波長范圍其波長范圍比用濾光片獲得的更窄。因此用分光比用濾光片獲得的更窄。因此用分光光度計可連續(xù)測量某一定濃度有色溶光度計可連續(xù)測量某一定濃度有色溶液在不同波長下的吸光度液在不同波長下的吸光度, 從而可得其從而可得其吸收光譜吸收光譜,通過吸收光譜可選擇最適宜通過吸收光譜可選擇最適宜

11、的測定波長。的測定波長。 所以分光光度計采用適當的光源所以分光光度計采用適當的光源 和檢測器和檢測器, 使測量的范圍不只局限于使測量的范圍不只局限于 可見光區(qū)。如用紅外光作為光源成可見光區(qū)。如用紅外光作為光源成 為紅外分光光度法為紅外分光光度法; 用紫外線作為光用紫外線作為光 源稱為紫外分光光度法。源稱為紫外分光光度法。 光電比色計和可見分光光度計的光電比色計和可見分光光度計的 基本部件基本部件光光 源源單色器單色器吸收池吸收池檢測器檢測器指示器指示器a. 光源光源 要求要求: 光源須具有足夠的輻射強度光源須具有足夠的輻射強度, 且穩(wěn)定性好。且穩(wěn)定性好。 鎢燈是可見分光光度計常用鎢燈是可見分光

12、光度計常用 的光源。的光源。b. 單色器單色器 光電比色計光電比色計: 用濾光片獲得單色光。用濾光片獲得單色光。 選擇濾光片的原則是選擇濾光片的原則是: 濾光片最易濾光片最易 透過的光應是有色物質最易吸收的透過的光應是有色物質最易吸收的 光光, 即濾光片的顏色與溶液的顏色應即濾光片的顏色與溶液的顏色應 為互補色為互補色; 也可以使用不同的濾光片也可以使用不同的濾光片 測量同一有色溶液的吸光度測量同一有色溶液的吸光度, 測得吸測得吸 光度最大時所用的濾光片就是最適光度最大時所用的濾光片就是最適 宜的濾光片。宜的濾光片。 分光光度計分光光度計: 單色器由棱鏡或光柵、單色器由棱鏡或光柵、狹縫和準直鏡

13、等部分組成。狹縫和準直鏡等部分組成。 棱鏡棱鏡: 色散元件色散元件, 有石英或玻璃兩有石英或玻璃兩種種, 它們對不同波長光具有不同的折它們對不同波長光具有不同的折射率。石英棱鏡對紫外光分光效果好射率。石英棱鏡對紫外光分光效果好, 玻璃棱鏡對可見光分光效果好玻璃棱鏡對可見光分光效果好, 因為因為玻璃對紫外光有吸收玻璃對紫外光有吸收, 故不能用于紫故不能用于紫外光區(qū)。外光區(qū)。 光柵光柵:色散元件色散元件, 利用光的衍射和干利用光的衍射和干 涉原理制成。當白光通過密刻平行條涉原理制成。當白光通過密刻平行條 痕的光柵后痕的光柵后, 將不同波長的光色散成將不同波長的光色散成 連續(xù)光譜。具有波長范圍寬、色

14、散均連續(xù)光譜。具有波長范圍寬、色散均 勻、分辨本領高等優(yōu)點。勻、分辨本領高等優(yōu)點。c. 吸收池吸收池(比色皿比色皿) 用于盛裝被測試液和參比溶液。用于盛裝被測試液和參比溶液。 按制作材料不同分為石英吸收按制作材料不同分為石英吸收 池和玻璃吸收池。池和玻璃吸收池。d. 檢測器檢測器 作用作用: 是將光強度信號轉換為可是將光強度信號轉換為可 測電信號測電信號, 常見檢測器有光電池和常見檢測器有光電池和 光電管。光電管。 光電池光電池: 國產國產581-G型光電比色型光電比色 計及計及72型分光光度計。型分光光度計。優(yōu)點優(yōu)點: 光電池靈敏度較高光電池靈敏度較高, 產生的光電產生的光電 池不需要經過放

15、大便可直接用池不需要經過放大便可直接用 靈敏檢流計測量。靈敏檢流計測量。缺點缺點: 光電池經強光照射或連續(xù)使用時光電池經強光照射或連續(xù)使用時 間過長間過長, 易產生易產生“疲勞現象疲勞現象”, 導導致致 靈敏度降低靈敏度降低, 遇此情況遇此情況, 應暫停使應暫停使 用并避光放置用并避光放置, 待其復原后再用。待其復原后再用。光電管光電管: 國產國產721型分光光度計型分光光度計e. 指示器指示器(3) 常用光電比色計和分光光度計常用光電比色計和分光光度計 光電比色計光電比色計: 國產國產581-G型型, 儀器通儀器通 常配有紅色、綠色、藍色三塊濾光常配有紅色、綠色、藍色三塊濾光 片片, 其透過

16、光的最大波長分別在其透過光的最大波長分別在650、 530和和440mm左右。左右。可見光光度計可見光光度計: 國產國產721型分光光度計型分光光度計四、顯色反應及其影響因素四、顯色反應及其影響因素 顯色反應顯色反應: 將被測組分轉變?yōu)橛猩珜⒈粶y組分轉變?yōu)橛猩?化合物的反應稱為顯色反應?；衔锏姆磻Q為顯色反應。 顯色劑顯色劑:使被測組分顯色的試劑稱使被測組分顯色的試劑稱 為顯色劑。為顯色劑。(1) 對顯色反應的要求對顯色反應的要求 選擇性好選擇性好 靈敏度高靈敏度高 有色化合物組成恒定有色化合物組成恒定 有色化合物的化學性質穩(wěn)定有色化合物的化學性質穩(wěn)定 顯色劑在測定波長處無明顯吸收顯色劑在測

17、定波長處無明顯吸收(2) 顯色劑顯色劑 顯色劑可分為無機顯色劑和有機顯顯色劑可分為無機顯色劑和有機顯 色劑兩大類。由于大多數有機顯色色劑兩大類。由于大多數有機顯色 劑能與金屬離子形成穩(wěn)定的有特征劑能與金屬離子形成穩(wěn)定的有特征 顏色的螯合物顏色的螯合物, 靈敏度較高靈敏度較高, 選擇性選擇性 也較好。因此也較好。因此, 在比色分析和光度分在比色分析和光度分 析中主要選用有機顯色劑。析中主要選用有機顯色劑。兩種常用的有機顯色劑：兩種常用的有機顯色劑： 鄰二氮菲鄰二氮菲 其結構式為其結構式為 這是目前廣泛用于測定這是目前廣泛用于測定Fe2+的較好的的較好的顯色劑。先用鹽酸羥胺把待測試液顯色劑。先用鹽

18、酸羥胺把待測試液中的中的Fe3+還原為還原為Fe2+ ,然后在然后在pH56的條件下的條件下,與鄰二氮菲反應與鄰二氮菲反應,生成穩(wěn)定生成穩(wěn)定的橙紅色配合物，配合物的的橙紅色配合物，配合物的max為為508nm.反應是特效的反應是特效的,靈敏度也較高，靈敏度也較高，摩爾吸光系數摩爾吸光系數為為1.1104L/mol.cm。. 雙硫腙雙硫腙 其結構式為其結構式為(3) 影響顯色反應的因素：影響顯色反應的因素： 顯色劑的用量：顯色劑的用量： 顯色反應表示式顯色反應表示式: M+R MR (被測組分被測組分)(顯色劑顯色劑)(有色配合物有色配合物) 顯色劑的用量應當適宜顯色劑的用量應當適宜,其用量是其

19、用量是 通過實驗確定。通過實驗確定。實驗方法為：固定被測組分的濃度和實驗方法為：固定被測組分的濃度和其它條件其它條件,改變顯色劑在溶液中的濃度改變顯色劑在溶液中的濃度cR,分別測量吸光度分別測量吸光度(A),繪制繪制A-cR曲線。曲線。 溶液的酸度溶液的酸度 適宜酸度范圍確定方法：適宜酸度范圍確定方法： 固定顯色劑和被測組分的濃度固定顯色劑和被測組分的濃度, 改變溶液的改變溶液的pH值值,分別測量吸光度分別測量吸光度, 繪制繪制A- pH曲線。曲線平坦部分所曲線。曲線平坦部分所 對應的對應的pH值即為適宜的酸度范圍。值即為適宜的酸度范圍。 顯色時間顯色時間 作吸光度作吸光度-時間曲線時間曲線,

20、 確定適宜的確定適宜的 顯色時間。顯色時間。 顯色溫度顯色溫度 溶劑的性質溶劑的性質 共存離子的干擾及其消除共存離子的干擾及其消除 消除共存離子干擾的方法：消除共存離子干擾的方法： a.控制溶液的酸度控制溶液的酸度 b. 加入掩蔽劑加入掩蔽劑 c. 分離干擾離子分離干擾離子五、光度測量條件的選擇五、光度測量條件的選擇 (1) 選擇合適波長的入射光選擇合適波長的入射光 選被測有色物質的選被測有色物質的max為入射為入射 光光 如在如在max處顯色劑或干擾組分處顯色劑或干擾組分 有明顯的吸收有明顯的吸收, 則應選靈敏度較則應選靈敏度較 低但能避免干擾的適宜波長的光低但能避免干擾的適宜波長的光 作為

21、入射光。作為入射光。(2) 選擇適宜的參比溶液選擇適宜的參比溶液 . 當被測溶液、顯色劑及所用其他當被測溶液、顯色劑及所用其他試劑均無色試劑均無色,可用純溶劑作為參比溶液可用純溶劑作為參比溶液, 稱為溶劑空白。稱為溶劑空白。 . 當顯色劑無色而被測試液中存在當顯色劑無色而被測試液中存在其他有色離子時其他有色離子時,可用不加顯色劑的被可用不加顯色劑的被測試液作為參比溶液測試液作為參比溶液,稱為試樣空白。稱為試樣空白。 . 當顯色劑或其他試劑有色當顯色劑或其他試劑有色,可用顯可用顯色劑或其他試劑作為參比溶液色劑或其他試劑作為參比溶液,稱為試稱為試劑空白。劑空白。. 用不含被測組分的試樣用不含被測組

22、分的試樣, 在相同條件在相同條件 下與被測試樣同時進行處理下與被測試樣同時進行處理, 測吸光測吸光 度時以前者所得溶液為參比溶液度時以前者所得溶液為參比溶液, 稱稱 為平行操作空白。如臨床上進行某為平行操作空白。如臨床上進行某 種藥物濃度的監(jiān)測種藥物濃度的監(jiān)測,取正常人血樣和取正常人血樣和 待測血藥濃度的血樣在相同條件下待測血藥濃度的血樣在相同條件下 處理處理, 用前者得到的溶液作為參比溶用前者得到的溶液作為參比溶 液。液。(3) 控制適當的吸光度讀數范圍控制適當的吸光度讀數范圍 適宜讀數范圍適宜讀數范圍: 吸光度吸光度A在在0.151.0內，內， 或透光度或透光度T值在值在0.100.70內。內。 六六.比色法和可見分光光度法的定量方法比色法和可見分光光度法的定量方法 (1) 校正曲線法校正曲線法(適用于經常性的批量分適用于經常性的批量分 析）析） (2) 標準對比法（標準品對照法）標準對比法（標準品對照法） 此法適宜于非經常性的分析工作。此法適宜于非經常性的分析工作。 當校正曲線通過零點時當校正曲線通過零點時,將樣品溶將樣品溶液和一標準溶液在選定實驗條件