Western印跡法

1、Western印跡法 這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對(duì)特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測(cè)之。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。 原理：與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白

2、質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)儀器：高壓鍋、玻璃勻漿器、高速離心機(jī)、分光光度儀、20低溫冰箱、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置、恒溫水浴搖床、多用脫色搖床。試劑：?jiǎn)稳ノ蹌┝呀庖骸?.01mol/L PBS (pH7.3)、10分離膠、4濃縮校、G250考馬斯亮藍(lán)溶液、4XSDS上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、封閉液、PBST、PBS、洗脫抗體緩沖液、顯影液、抗體、化學(xué)發(fā)光試劑。雜品與耗

3、材：各種規(guī)格的吸頭、離心管和加樣器；各種規(guī)格的燒杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纖維素膜，乳膠手套，保鮮膜，搪瓷盤（>20×20cm），X-光片夾，X-光片，玻棒長(zhǎng)短各一根，計(jì)時(shí)器，吸水紙，試劑配制：（一）母液一 SDS-PAGE電泳10SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml50水浴下溶解，室溫保存。如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10過硫酸胺（AP）過硫酸胺 0.1g 超純水 1.0ml溶解后，4保存，保存時(shí)間為1周。1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)

4、pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g 超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。40Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉雙丙稀酰胺（Bic） 1g超純水至 100ml37下溶解后，4保存。使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。（二）使用液（PMSF）單去污劑裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX100，100mg/

5、ml PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸餾水至 50ml 混勻后， 4保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為100mg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。 PBS（ pH 7.2-7.4）KH2PO4 0.27gNa2HPO4 1.42gKCl 0.2gNaCl 8g 蒸餾水至 800ml用濃鹽酸調(diào)PH至7.5定容至1L PBST （非離子型去污劑）: 及含 0.05% -0.5(0.2%)TWEEN-20的PBS 封閉液: 及含 5% 脫脂奶粉的 PBST G2

6、50考馬斯亮藍(lán)溶液（測(cè)蛋白含量專用） 考馬斯亮藍(lán)G250： 100mg 95乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸餾水至 1000ml 配制時(shí)，先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4保存。15分離膠和5濃縮校 15分離膠 5濃縮膠超純水 920ml 980ml40Acr/Bic（37.5：1） 2ml 267ml1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 1ml 0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 300ml10SDS 40 ml 17 ml10%AP（過硫酸胺） 40ml 17 mlTEMED 4 ml 3.5 ml

7、加TEMED后，立即混勻即可灌膠。4×樣品緩沖液 還原型(10ml): Tris 0.303 g -巰基乙醇 2 ml SDS 0.8 g 溴酚蘭 0.002 g 甘油 4 ml 濃鹽酸 189 l 加超純水定容至10ml。 用微量離心管分裝后，凍存。 非還原型（10ml）： Tris 0.303 g SDS 0.8 g 溴酚蘭 0.002 g 甘油 4 ml 濃鹽酸 189 l 加超純水定容至10ml。用微量離心管分裝后，凍存。 混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4保存。電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，0.19mmol/L甘氨酸，0.1 SDS） Tris（MW121.1

8、4） 3.03g 甘氨酸（MW75.07） 14.4gSDS 1g蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35次。轉(zhuǎn)移緩沖液（25mmol/L Tris，19mmol/L甘氨酸，20甲醇）甘氨酸（MW75.07） 14.4gTris（MW121.14） 3.03g 甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35次。封閉液（含5脫脂奶粉的PBST緩沖液）脫脂奶粉（國(guó)產(chǎn)，安怡牌） 5g PBST 100ml溶解后4保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。洗脫抗體緩沖液: PBST冰乙酸 12.6ml硼酸 7.5g鉀明礬 15g（水溫冷至3

9、0以下時(shí)再加入）加水定容至1000ml，室溫保存抗體 用PBST稀釋至一定濃度使用，每張膜需0.5mlDAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中彬金橋公司，分A,B和C三種試劑。操作步驟：（一） 蛋白樣品制備（1） 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：1、 倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、 每瓶細(xì)胞加3ml 4預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.27.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、 按1ml裂解液加10 ml PMSF（100mM），

10、搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）4、 每瓶細(xì)胞加400 ml含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。5、 裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）6、 于4下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）7、 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5min的離心管中放于20保存。（2） 組織中總蛋白的提?。?、 將少量組織塊置于12ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2、 加400 ml單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿

11、器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。3、 幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4、 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20保存。（3） 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：1、 將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。2、 棄上清，加入4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。3、 用槍洗干上

12、清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。4、 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20保存。（二） 蛋白含量的測(cè)定（1） 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1、 從20取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2、 取18個(gè)1.5ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0mg，2.5mg，5.0mg ，10.0mg ，20.0mg ，40.0mg。3、 按下表在各管中加入各種試劑。0mg2.5mg5.0mg10.0mg20.0mg40.0mg1mg/ml BSA2.5ml5.0ml10.0ml20

13、.0ml40.0ml0.15mol/L NaCl100ml97.5ml95.0ml90.0ml80.0ml60.0mlG250考馬斯亮藍(lán)溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、 混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計(jì)（BioPhotometer，Eppentoff）上比色分析。5、（2） 檢測(cè)樣品蛋白含量1、 取足量的1.5ml離心管，每管加入4儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測(cè)蛋白。2、 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測(cè)空白樣品。3、 棄空白樣品

14、，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用無菌水洗一次。4、 取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5ml待測(cè)蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測(cè)樣品。注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次。可同時(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè)，這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。（三） SDSPAGE電泳（1） 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2） 灌膠與上樣1、 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后

15、垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。）2、 按前面方法配15分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用1ml槍吸取膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）3、 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了。再等3-5min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。4、 按前面方法配5的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也

16、要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出(最好在SDS電泳緩沖液中放置一段時(shí)間潤(rùn)濕后再拔出梳子)。5、 將濃縮膠放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）6、 取出上樣樣品至1.5ml離心管中，加入4×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×。（90ul樣品和30ul 4×SDS 上樣緩沖液）（上樣總體積一般不超過10ml，加樣孔

17、的最大限度可加15-20ml樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5min使蛋白變性，離心10min取上清點(diǎn)樣。7、 加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。（3） 電泳電泳時(shí)間一般0.5 h，電壓為80V較好，然后加壓用160V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。（四） 轉(zhuǎn)膜（1） 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7濾紙和1張PVDF膜(大小和膠一樣大小)。切濾紙和膜時(shí)

18、一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的PVDF膜置于甲醇上浸5-10min才可使用。（2） 在加有轉(zhuǎn)移液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜和膠。（3） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒（離心管）來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動(dòng)。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。（4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（

19、濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動(dòng)）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡(動(dòng)作要輕，以免搟破膠)。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通。）（5） 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60V轉(zhuǎn)移2 h或40V轉(zhuǎn)移3 h（50V轉(zhuǎn)移2.5h）。（6） 轉(zhuǎn)完后將膜用PBST液于脫色水平搖床上搖。用PBST洗掉電轉(zhuǎn)