高效率構(gòu)建包含內(nèi)含子的hpRNAi植物載體

1、高效率構(gòu)建包含內(nèi)含子的hpRNAi植物載體摘 要在植物基因功能分析中廣泛使用的雙鏈RNA干擾（RNAi），是一種高效率的系統(tǒng)，對于制作發(fā)夾RNA（hpRNA）結(jié)構(gòu)有一個很大的需求量。在這里，我們描述了一種新的限制性連接方法，提供了包含內(nèi)含子的hpRNA（ihpRNA）載體的一種簡單而高效的建設(shè)。該系統(tǒng)以優(yōu)勢型IIS的限制性內(nèi)切酶BsaI和我們新的植物RNAi載體pRNAi-GG（GG）以GG克隆為基礎(chǔ)。這種方法需要有感興趣的基因的BsaI識別序列側(cè)翼只有一個單一的PCR產(chǎn)物，然后可以克隆到pRNAi-GG上在正方向和反方向同時形成ihpRNA的構(gòu)造。在這個過程中，在一個管與一個限制性連接步驟完

2、成后，產(chǎn)生的重組ihpRNA具有高效率和零背景。我們證明與pRNAi-GG載體向量生成的ihpRNA結(jié)構(gòu)的效用有效沉默各種單獨的內(nèi)源和外源標志物基因以及同時沉默這兩個基因。此方法提供了植物功能基因組學(xué)的大規(guī)模分析的新穎的和高效率的平臺。介紹在雙鏈RNA被發(fā)現(xiàn)作為一體的能觸發(fā)RNA干擾（RNAi）之后1，RNA干擾也成為一個基因功能2-4分析的最強大的工具。 發(fā)夾RNA（hpRNA）結(jié)構(gòu)通常用于通過RNA干擾5的機制來誘導(dǎo)靶基因的degra-dation。在植物中，含有發(fā)夾RNA的內(nèi)含子（ihpRNA）配有一個內(nèi)含子作為間隔序列表示出了最高基因沉默效率6。因此，ihpRNA結(jié)構(gòu)已被廣泛用于植物中

3、的基因沉默。與在植物中基因序列的爆炸性釋放和基因組序列，高效率和成本制作ihpRNA結(jié)構(gòu)系統(tǒng)需求量很大。為了便于ihpRNA結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，幾種方法已經(jīng)被報道。傳統(tǒng)的連接酶的載體如pHANNIBAL和pKANNIBAL首次使用生成ihpRNA結(jié)構(gòu)6。該方法需要幾輪限制和連接，并且因此，比較乏味和耗時。有一種可替代地方法，GATEWAY克隆系統(tǒng)為基礎(chǔ)的RNAi載體如pHELLSGATE系列和PIPK系列已被廣泛用于產(chǎn)生ihpRNA結(jié)構(gòu)7-9。在這個系統(tǒng)中，一個單一的PCR產(chǎn)物，從含有適當(dāng)attB1和attB2位點的引物，可以是同時重組到載體中以形成所述兩個臂的發(fā)夾。因此，它比傳統(tǒng)的基于連接酶的系統(tǒng)更

4、簡單和更快速。然而，該方法通常需要兩個克隆步驟，包括BP和LR反應(yīng)生成最終ihpRNA。此外，使用的試劑系統(tǒng)是相當(dāng)昂貴的，特別是對在發(fā)展中國家研究人員。除了傳統(tǒng)的基于連接酶系統(tǒng)和GATEWAY系統(tǒng)中，幾個重疊擴展（OE）PCR方法被開發(fā)來構(gòu)建ihpRNA盒子。一個叫DA-ihpRNA方法，用于直接從基因組DNA擴增ihpRNA結(jié)構(gòu)，被描述Xiao等10。我們實驗室先前報道的混合單步驟OE-PCR方法，通過組裝靶基因的兩個反向重復(fù)片段并且在一個管內(nèi)的內(nèi)含子11產(chǎn)生ihpRNA結(jié)構(gòu)。陳等人采用了類似的策略構(gòu)建其立即插入由TA克隆12的最后的植物表達載體ihpRNA盒子。這些基于PCR的方法不僅比常

5、規(guī)的基于連接酶系統(tǒng)更簡單和快速，而且比GATEWAY系統(tǒng)還更有成本效益。然而，它們有時會遭受低的效率，因為PCR抑制效果導(dǎo)致兩個反向重復(fù)序列，特別是對于那些靶基因序列的自退火包含富含GC的區(qū)域和/或可以形成序列二級結(jié)構(gòu)。最近，對于一個一步法構(gòu)建hpRNA的100的效率是基于連接獨立克?。↙IC）使用pRNAi-LIC載體，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)13。這種方法簡單快捷，因為它可以生成ihpRNA結(jié)構(gòu)用一步法轉(zhuǎn)換用于植物RNA沉默。但是，它仍然需要兩輪PCR為擴增不同適配器的兩個反向重復(fù)和一系列的限制性酶切的矢量線性化在使用ligation-獨立克隆之前。為了開發(fā)制作一個更簡單的RNAi構(gòu)建系統(tǒng)，我們采用的是

6、Golden Gate（GG）克隆的方法。此克隆策略依賴于IIs型限制性酶，其切割產(chǎn)生的DNA突出端被任意定義在識別序列外側(cè)。此屬性已被用于在單個連接反應(yīng)中開發(fā)多種DNA片段的高效定向組件協(xié)議14,15。此外，在切割位點的適當(dāng)?shù)脑O(shè)計，二消化的片段可被連接，以產(chǎn)生缺乏原始的限制性位點的產(chǎn)物。由此，消化和連接這兩個步驟可以由一個單一的限制性連接步驟所取代。根據(jù)Golden Gate克隆的這些特性，我們在這里描述，通過我們新的植物RNAi載體pRNAi-GG的構(gòu)建，一步法和成本效用能產(chǎn)生ihpRNA有效的方法。利用這個系統(tǒng)，一個植物ihpRNA表達載體可以從感興趣的基因的單一PCR產(chǎn)物通過單管限制性

7、連接反應(yīng)和一步轉(zhuǎn)化制成。該方法已成功地應(yīng)用于產(chǎn)生ihpRNA構(gòu)建其他各種內(nèi)源性和外源性標記基因以及兩個基因同時有效沉默。我們的結(jié)果表明，這種新方法提供了一種制造ihpRNA構(gòu)建體的高通量和可靠的平臺，由此，可以促進在植物中的一個大型功能基因組學(xué)分析。結(jié)果為了構(gòu)建ihpRNA載體而發(fā)展Golden Gate策略通過使含內(nèi)含子的反向重復(fù)快速和高通量克隆到載體中一個Golden Gate 策略，我們開發(fā)了一種新的植物的T-DNA的RNAi載體，pRNAi-GG。這個載體由在重復(fù)的CaMV35S啟動子和Nos終止子之間的ccdb基因 - Pdk內(nèi)含子 - ccdb基因（圖1A）。在原有的ccdB基因中

8、，一個BsaI識別位點，被不改變編碼的氨基酸序列的位點特異性突變消除。兩個BsaI位點側(cè)翼每個CCDB基因和被定位的酶切位點在載體中被消除，在合適的產(chǎn)物酶切和連接后。 BsaI對第一CCDB基因的左側(cè)切割位點和第二個CCDB的右側(cè)的序列是相同的，但具有不同的方向和其他兩個BsaI位點相同。因此，一個單一的PCR產(chǎn)物可以在正義和反義方向同時替換兩個CCDB基因以形成發(fā)夾（圖1B）的兩個臂。使ihpRNA構(gòu)造中，感興趣的基因的目標區(qū)域擴增在兩端側(cè)接BsaI識別位點，和切割位點的序列（適配器pRNAi-GG）是在載體上的合適的序列是互補的。引物設(shè)計的普遍形式是59-保護堿基 - BsaI - 適配器

9、pRNAi-GG - 基因序列特異性39。在BsaI酶和T4連接酶的存在下，純化的PCR產(chǎn)物和pRNAi-GG的孵化產(chǎn)生所需要的載體。由于不存在原來的BsaI位點（圖1B），它是穩(wěn)定的。該混合物然后可以直接轉(zhuǎn)化到標準的大腸桿菌菌株中，如DH5中和TOP10（但不是在DB3.1），只含兩個臂的重組體將被回收。因為pRNAi-GG是二元載體，重組pRNAi-GG構(gòu)建體可以反式直接轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌用于植物轉(zhuǎn)化。植物ihpRNA構(gòu)建體pRNAi-GG快速和高效的克隆為了測試我們的新的植物RNAi載體pRNAi-GG的制造ihpRNA構(gòu)建體的效率，在標志物基因的GFP（GenBank登記接入號碼U87973

10、）的337 bp的一個目標區(qū)域進行擴增，并與pRNAi-GG在BsaI酶和T4連接酶存在下混合。在不同的限制性連接時間的克隆效率，將混合物在37uC孵育0.5-2 h或為20-35個循環(huán)（2分鐘37uC + 5分鐘16uC）。在80uC 5分鐘熱滅活后，將該混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5細胞并選擇在含卡那霉素和氯霉素的LB平板中涂布。如表1中所示的，重組菌落是在增加從0.5到2小時或20至35個循環(huán)的形式。在37uC克隆2小時的效率高于20個周期，但比35個循環(huán)稍低。考慮到時間效率，在37uC溫育2小時被認為是最佳條件。對于每一個轉(zhuǎn)化，12個克隆使用載體特異性引物P21和P22通過PCR進行鑒定，

11、并插入反向引物P12（圖S1中，表S1），它可以同時擴大兩個臂使其有（當(dāng)小于12，拾取全部） 267 bp的長度的差異。所有的克隆通過瓊脂糖凝膠電泳顯示預(yù)期的條帶，作為結(jié)果的一部分在圖 2A中展示。 12個克隆還確定通過限制性內(nèi)切酶消化使用BamHI和SacI鑒定（圖S1）。如圖2B所示，所有的菌落包含正確的插入，并在消化的兩種不同位點的插入是由于內(nèi)含子的方向不同。內(nèi)含子的方向，也可以很容易地通過菌落PCR鑒定，使用兩個內(nèi)含子特異性引物P24和P25和一種載體特異性引物P21（表S1，圖2C）的組合確定的。載體插入連接，六個菌落，采用P22和P23引物進行測序和他們都包含了正確的預(yù)期序列。在p

12、RNAi-GG，氯霉素抗性基因插入到PDK內(nèi)含子，以允許用于選擇內(nèi)含子（圖1A）的存在。為了測試氯霉素抗性基因的重要性，在回收的正確的重組產(chǎn)物，我們比較了在存在和不存在的氯霉素的重組質(zhì)粒。超過50氯霉素抗性克隆通過PCR檢測，以及所有被發(fā)現(xiàn)具有正確的結(jié)構(gòu)。而在不存在氯霉素，克隆的10-20被發(fā)現(xiàn)沒有內(nèi)含子。從三個非法重組序列顯示載體本身的重組產(chǎn)物的兩個終止子的位置（未顯示數(shù)據(jù)）。因此，我們的結(jié)論是在內(nèi)含子的選擇標記是必要的對于ihpRNA產(chǎn)生構(gòu)建體當(dāng)我們在使用這個系統(tǒng)的時候。為了證明，在用Golden Gate 方法開發(fā)ihpRNA構(gòu)建體時，載體pRNAi-GG的使用是可重復(fù)的和可靠的，我們還

13、成功地產(chǎn)生其它重組pRNAi-GG構(gòu)建體，包括從本塞姆氏煙草PDS基因的目標區(qū)域（NbPDS）（GenBank登記接入號碼EU165355）和標記基因的GUS（GenBank登記接入號碼AY292368），以及來自GFP的具有內(nèi)部BsaI位點另一個目標區(qū)域（圖2D）。要繞過內(nèi)部BsaI位點的問題，兩步連接法被使用。在第一步限制連接的2小時后，將酶熱滅活，然后將新鮮連接酶加入到該混合物1小時進行第二連接。通過農(nóng)桿菌NbPDS的外源標記基因和內(nèi)源性沉默Coinfiltration已被廣泛使用，以確定該功能 - RNAi構(gòu)建為標記基因的沉默。為了證明ihpRNA構(gòu)造（如上所述）可用于基因沉默，我們首

14、先測試pRNAi-GUS和pRNAi-GFP的基因沉默通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達的能力。農(nóng)桿菌培養(yǎng)，每片含pBIN19-GUS和pBIN19-GFP和農(nóng)桿菌培養(yǎng)物混合，各自含有pRNAi-GUS或pRNAi-GFP（對于對照），和pRNAi-GFP或pRNAi-GUS（對于對照）。該混合農(nóng)桿菌培養(yǎng)物滲透到本塞姆氏煙草植物的相同葉片的不同部分?？刂茲B透區(qū)域給予了強的藍色GUS染色信號（圖3A）或綠色熒光（圖3B）在3天后農(nóng)桿菌滲入。然而，對于基因沉默的滲透區(qū)，得到弱得多的信號。確認測試標記基因在分子水平上的擊倒，我們進行了實時PCR。結(jié)果表明，GUS和GFP mRNA水平分別減少至24和36，相對

15、于對照樣品（圖3C）。除了外源標志物基因，NbPDS的mRNA水平也由含有pRNAi-PDS農(nóng)桿菌培養(yǎng)物的浸潤減少。實時PCR的結(jié)果表明，NbPDS在3天后農(nóng)桿菌滲入的表達減少至17，比對照樣品（圖3C）。然而，PDS沉默，例如在VIGS（病毒誘導(dǎo)的基因沉默）的光致漂白的典型表型，未在浸潤區(qū)域甚至15天后浸潤觀察。的原因可能是在RNA的由農(nóng)桿菌滲入介導(dǎo)的干擾是短暫的并反應(yīng)的植物，其不能達到改變的表型的電平小的區(qū)域。轉(zhuǎn)基因的一般，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時EX- PRESSION在2-3天之后argoinfiltration，在這之后的表達水平迅速降低16達到最高水平。重組的pRNAi-GG的內(nèi)含子的方向

16、影響沉默效率由于在該pRNAi-GG載體的PDK內(nèi)含子的兩側(cè)BsaI的同一切割位點，我們觀察到，重組ihpRNA載體包括質(zhì)粒，其中所述內(nèi)含子保留了它的正向或反向的方向相對于該啟動子而言。內(nèi)含子的方向可以很容易地通過使用兩個內(nèi)含子特異性引物P24和P25和一種載體特異性引物P21的組合的菌落PCR鑒定（表S1，圖2D）或通過限制酶使用BamHI和SacI（圖2C）消化鑒定。引物和pRNAi-GG上的限制性位點的位置在圖 S1中顯示。來測試重組pRNAi-GG的內(nèi)含子的方向?qū)虺聊牡挠绊懀琾RNAi-GFP和pRNAi-PDS在正義或反義方向的內(nèi)含子被選擇并用于瞬時表達測試。如圖4所示，重組p

17、RNAi-GG用不同的內(nèi)含子的方向之間觀察到沉默效率沒有明顯的差異。因此，內(nèi)含子方向的選擇不是關(guān)鍵的，并且如果需要，它可以容易地通過菌落PCR或限制性內(nèi)切酶消化確認。GFP和NbPDS同時沉默考慮到Golden Gate 克隆的極高的效率，這是合乎邏輯的，去測試多個片段是否可以插入到pRNAi-GG。為此，我們制定了一項戰(zhàn)略來構(gòu)建ihpRNA在一個單一的針對兩個不同的基因克隆步驟（圖5A）。兩個插入片段都與BsaI位點的左右兩邊相連，其切割位點序列被設(shè)計成使得兩個插入物可在消化后連接。在不同的限制性連接時間里克隆的效率進行了測試，結(jié)果顯示的最佳條件是在16uC（表1），用于在37uC2分鐘，5

18、分鐘50個循環(huán)溫育。通過采用這種戰(zhàn)略的ihpRNA，即pRNAi-GFP/ PDS，針對GFP和NbPDS構(gòu)建成功（圖2D）。含有GFP和所述pRNAi- GFP農(nóng)桿菌培養(yǎng)/ PDS被coinfiltrated入本塞姆氏煙草植物的葉子上。 GFP和NbPDS的同時沉默觀察3天后農(nóng)桿菌滲入（圖5B）。討論由ihpRNA誘導(dǎo)的RNA沉默是在反向遺傳學(xué)最強大，最流行的工具之一。ihpRNA構(gòu)建體已被廣泛用于在植物中基因功能的分析。在植物中基因序列和全基因組序列的爆發(fā)性的釋放，如何迅速地確定大規(guī)模的基因功能是一項艱巨的挑戰(zhàn)。在這項研究中，我們開發(fā)了一個新的戰(zhàn)略和新的植物RNAi載體，pRNAi-GG，

19、為使ihpRNA只有一個限制性連接克隆步驟迅速構(gòu)建。我們已經(jīng)表明，ihpRNA構(gòu)建體，基于Golden Gate 克隆方法的RNAi載體的產(chǎn)生，能有效地誘導(dǎo)靶基因的抑制。這種新穎的方法和我們的植物RNAi載體為大型植物功能基因組分析提供了高通量平臺。我們介紹的方法比以傳統(tǒng)的連接酶為基礎(chǔ)和GATEWAY系統(tǒng)有很多優(yōu)點。首先，ihpRNA構(gòu)建體可以在一個管中來產(chǎn)生一種限制性連接步驟。 ihpRNA構(gòu)建的克隆過程可以在幾個小時內(nèi)完成。第二，我們的方法只需要一個單一的引物對和普通試劑，它們是相對節(jié)省成本。第三，有CCDB和氯霉素抗性基因兩者，我們的新的載體pRNAi-GG可以用來具有零背景克隆效率ih

20、pRNA構(gòu)建體。第四，pRNAi-GG是一個二元載體;從而，允許重組pRNAi-GG構(gòu)造來直接轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌用于植物轉(zhuǎn)化。總之，這些優(yōu)點大大方便和提高大規(guī)?；蚬δ芊治龅母咄康膽?yīng)用程序。最近，對于ihpRNA的一步法生成與基于使用pRNAi-LIC載體連接獨立的克隆（LIC）100的效率構(gòu)造，已經(jīng)被開發(fā)13。這種方法具有幾乎所有的上述優(yōu)點。但是，它仍然需要兩輪PCR擴增兩個反向重復(fù)序列和限制性內(nèi)切酶消化的載體克隆的一個步驟。另一方面，我們的方法僅要求一個單一的PCR產(chǎn)物，它可以立即克隆到pRNAi-GG并且無任何其它要求。因此，我們的方法是簡單和快速。至少，它是用于制備一種很好的制造高通量的R

21、NAi構(gòu)建體的替代系統(tǒng)。由于在pRNAi-GG載體PDK內(nèi)含子的兩側(cè)的BsaI的同一切割位點，我們觀察到，重組ihpRNA載體包括質(zhì)粒在內(nèi)含子反向或保留了其正方向相對于所述的啟動子子。類似的結(jié)果也在基于GATEWAY系統(tǒng)7,17的pHELLSGATE載體觀察到。在重組ihpRNA內(nèi)含子的反向方向通常被認為在沉默效率中具有負面影響，因此，在一些RNAi載體隔板片段被設(shè)計為包含在相反方向的兩個內(nèi)含子，以確保內(nèi)含子中的一個是在正方向的 7。但是，沒有數(shù)據(jù)被報道內(nèi)含子的方向影響基因沉默。我們比較內(nèi)含子的正向和反向?qū)hpRNA載體的沉默效率，發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子的方向?qū)Τ聊蕸]有明顯的影響。因此，內(nèi)含子方向的

22、選擇不是關(guān)鍵的，并且如果需要，它可以容易地通過菌落PCR或限制性內(nèi)切酶消化確認。我們的方法是基于IIs型限制性內(nèi)切酶BsaI。因此，這種方法的一個潛在的限制可能來自一個的偶然的存在對于感興趣的基因的幾個內(nèi)部BsaI位點。為了解決這個問題，我們加入新鮮連接酶進行的限制性連接2小時，隨后酶熱失活，然后再加入新鮮連接酶連接1個小時。其結(jié)果是，一個ihpRNA含有一個內(nèi)部的BsaI限制性位點，成功構(gòu)建（圖2D）。我們發(fā)現(xiàn)這是由于限制連接極其有效，在第一步驟中，穩(wěn)定地連接在載體的末端插入片段，并且第二步連接只需要再連接內(nèi)部BsaI部位突出端15。由于BsaI限制性位點具有6個堿基對識別序列，預(yù)計到存在于

23、基因組中的每四個kb的平均值。由于ihpRNA的莖長度一般約500bp，概率多個BsaI位點是非常不可能的。因此，內(nèi)部BsaI位點的偶然存在將不會限制本方法的應(yīng)用。Golden Gate 克隆是建立在IIs型限制性酶的使用上，并允許多個DNA片段的裝配在一個限制性連接反應(yīng)中。根據(jù)Golden Gate克隆的幾個協(xié)議已經(jīng)報道了DNA改組14，遺傳模塊18,19，長度的DNA20和轉(zhuǎn)錄活化劑 - 樣（TAL）效應(yīng)21-24的組件。在這項研究中，我們通過Golden Gate克隆，使高通量ihpRNA構(gòu)建。在我們的方法中，重組體可以立即在PCR產(chǎn)物和目標質(zhì)粒中產(chǎn)生，而不在原始的Golden Gate

24、 克隆中進入和目的地質(zhì)粒。這意味著，PCR產(chǎn)物的亞克隆是不必要的，這進一步增強了高通量建設(shè)ihpRNA的?？傊覀円呀?jīng)開發(fā)出一種簡單，快速并且可靠的制作ihpRNA結(jié)構(gòu)的方法。這種方法被證明是有前途在廣泛應(yīng)用為植物功能基因組學(xué)的大規(guī)模分析。方法植物和質(zhì)粒材料野生型本塞姆氏煙草被用于瞬時沉默的分析。pBIN19-GUS和pBIN19-GFP被基于pBIN19并各自用于GUS和GFP的表達。所有的質(zhì)粒室友由麥斯特博士25提供。 pBI121的是用于植物轉(zhuǎn)化26的二元載體。植物RNAi載體pRNAi-GG構(gòu)建體使用T-DNA的載體pBI121作為骨架生成pRNAi-GG載體。復(fù)制的CaMV 35S

25、啟動子，用pSATN-cEYFP-C1 27作為模板擴增的。 CCDB基因的兩個拷貝和PDK內(nèi)含子含有氯霉素抗性基因是使用pRNAi-LIC 13作為模板的PCR擴增。在原始CCDB基因BsaI位點是由重疊PCR方法除去的，而不改變其氨基酸序列，以及被修飾的CCDB基因是在BsaI位點兩側(cè)。這些引物序列列于表S1。所有四個PCR產(chǎn)物克隆到T-載體PMD-18T，然后用HindIII和ApaI，ApaI和SalI，SalI和XbaI，XbaI和SacI分別消化。最后，四個消化片段是被連接到HindIII-和SacI消化的pBI121，在一個管中，以產(chǎn)生pRNAi-GG。 pRNAi-GG用于產(chǎn)生

26、所有ihpRNA構(gòu)建用于這個研究的基因沉默，并維持在大腸桿菌菌株DB3.1，其中CCDB基因不是致命的。 pRNAi-GG的全長序列和詳細注釋沉積于GenBank（訪問號碼JQ085427）。用Golden Gate 克隆法制造 ihpRNA構(gòu)建體 pRNAi-GG為了沉默pRNAi-GG載體感興趣的基因，我們通過Golden Gate 克隆法，去制造ihpRNA構(gòu)建體時，只有一個單一的PCR產(chǎn)物是被需要的。該產(chǎn)品是由低聚物擴增的：59- acca ggtctc aggag - 基因特異性正向引物39和59-acca ggtctc atcgt-基因特異性反向引物39（59-保護堿 - BsaI

27、 - 適配器pRNAi-GG - 基因特異性序列39）。制作ihpRNA構(gòu)建體的Golden Gate 反應(yīng)是被50納克純化的PCR產(chǎn)物所設(shè)置，200納克pRNAi-GG載體，5單位BsaI酶（NEB）和10單位T4 DNA連接酶（Promega公司，高濃度的連接酶 - 20/ ml）的10 mlin16連接緩沖液（Promega）中的總體積。限制性連接在37uC保溫2小時，接著孵育在50uC（最終消化）5分鐘，然后在80uC 5分鐘（熱滅活）。然后5-10毫升混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞中，涂布含有25mg / L卡那霉素和5毫克/升的LB培養(yǎng)基上從而篩選重組體。用于沉默GUS，GF

28、P和NbPDS的ihpRNA構(gòu)建體是由該限制 - 連接反應(yīng)中產(chǎn)生并分別命名為pRNAi-GUS，pRNAi-GFP和pRNAi-NbPDS。這些構(gòu)建通過PCR和DNA測序證實。這些引物序列列于表S1。通過農(nóng)桿菌的瞬時表達從先前報道的程序中，農(nóng)桿菌滲入有輕微的變形例28。煙草植物在25uC標準條件下的生長室下16小時光照/ 8小時黑暗周期生長。所有ihpRNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株GV3101。每個轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的單個菌落用于接種5毫升YEP培養(yǎng)基（細菌用胰蛋白胨10克/升酵母提取物，10g/升;氯化鈉，5克/升; pH7.0）其中含有100毫克/升利福平和50毫克/升卡那霉素。細菌生長過夜，得到1.0-1.5在28uC的OD 600，以200rpm振蕩。將培養(yǎng)物離心2000轉(zhuǎn)沉淀5分鐘，細胞用浸潤緩沖液（50mM MES pH為5.6，10mM的MgCl 2和100mM的乙酰丁香酮）稀釋至0.1-0.3的最終OD 600，然后