利用乳酸菌制備納米氧化鋅復(fù)合物的工藝研究

1、中北大學(xué)2016屆畢業(yè)論文Study on Preparation of nano zinc oxide composites using Lactobacillus salivariusAbstract:In this experiment,the use of saliva lactic acid bacteria and zinc sulfate mixture to prepare nano - Zinc Oxide, The analysis of pH, water bath temperature, water bath time effect of reaction

2、products production,And the effect of the reaction products on the E.coli and Staphylococcus aureus were detected.Results show,Preparation of pH has a significant influence on the amount of preparation, and the water bath time and temperature on the reaction volume had no significant effect.The reac

3、tion products of the best preparation technology of water bath temperature of 75 degrees centigrade, water bath time is 25min, pH is 6.5. The reaction products were used to detect the inhibitory effect of Escherichia coli and Staphylococcus aureus.Results show,The reaction products of each group wer

4、e able to produce a clear inhibition zone to E. coli, and the possibility of acid, lactic acid bacteria, lactic acid bacteria secretion, and the antibacterial activity of zinc sulfate were eliminated,All of the products produced in the products have antibacterial effect of nano Zinc Oxide. In the fu

5、rther pathogenic bacteria growth inhibition test, each group of products can significantly inhibit the growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus,The highest inhibition rate was 59.9%, the lowest was 21.5%. The 1mg/ml reaction product was the highest inhibition rate, up to 14.9%, and the l

6、owest was 4.2%.Of each product group total inhibition rate and inhibitory rate were significantly different. Combined with yield and bacteriostatic rate index, this experiment obtained by Lactobacillus salivarius of preparation of the optimal conditions for the reaction products to 55 DEG C water ba

7、th temperature, bath time 35min, pH of 5.5.Key words：Zinc Oxide,Lactobacillus salivarius,inhibition rate 目 錄1 前言11.1 概述11.2 納米技術(shù)的進(jìn)展11.3 乳酸菌的生物學(xué)特征及其性質(zhì)11.3.1 乳酸菌的分類11.3.2 細(xì)菌生物膜的特性21.3.3 飼用乳酸菌微生物制劑21.4 納米氧化鋅的合成21.4.1 納米氧化鋅的無機(jī)合成21.4.2 納米氧化鋅的生物合成31.4.3 納米氧化鋅的抑菌31.4.4納米氧化鋅在飼料中應(yīng)用 31.5 本課題的要求、目的及意義42 材料與方法5

8、2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品52.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器52.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品52.3 試劑配制及滅菌52.4 實(shí)驗(yàn)方法52.4.1 菌種活化52.4.2 制備納米氧化鋅62.4.3 納米氧化鋅的制備工藝62.4.4 反應(yīng)液中菌體活性測定82.5 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的抑菌效果測定82.5.1 大腸桿菌抑菌圈的測定方法82.5.2 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌生長性能的影響82.6 反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌生長性能的影響82.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析93 結(jié)果與分析103.1 不同制備條件下沉淀產(chǎn)物質(zhì)量的得率103.1.1 水浴溫度對反應(yīng)沉淀質(zhì)量的影響及分析103.1.2 水浴時間對沉淀產(chǎn)物質(zhì)量的影響及分析103.1.

9、3 pH對產(chǎn)點(diǎn)產(chǎn)物的影響及分析113.2 反應(yīng)液菌體活性測定123.3 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌抑菌效果測定與分析123.3.1 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的抑菌圈的影響123.3.2 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌生長性能的影響153.4 反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌生長性能的影響173.4.1 不同水浴時間制備的反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌OD值的影響183.4.2 不同pH制備的反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌OD值的影響193.4.3 不同水浴溫度制備反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌OD值的影響204 結(jié)論22附錄A 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及儀器一覽表23附錄B 主要藥品及試劑一覽表24參考文獻(xiàn)25致謝271 前言1.1 概述 乳酸菌是一類能利用碳

10、水化合物產(chǎn)生乳酸的非病原性、革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱，包括乳桿菌、乳球菌和雙歧桿菌等至少23個屬。一些乳酸菌是人和動物的胃腸道和雌性生殖道的共生菌，可以促進(jìn)人和動物的健康。此外，乳酸菌作為重要的益生菌已廣泛地用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)中，被公認(rèn)為是安全的食品級微生物1。 納米氧化鋅是一種面向21世紀(jì)的新型高功能精細(xì)無機(jī)產(chǎn)品，其粒徑介于1100 nm，又稱超微細(xì)氧化鋅，是比較成熟的納米級微量元素產(chǎn)品，具有一般氧化鋅無法比擬的性能。納米氧化鋅在動物體內(nèi)可以通過被動擴(kuò)散被吸收，降低對載體及能量消耗，提高吸收利用率，降低氧化鋅在飼料中的添加量。飼料中添加納米氧化鋅還能夠提高機(jī)體抗氧化能力、增強(qiáng)免疫力、降低

11、腹瀉率及提高動物生產(chǎn)性能2。1.2 納米技術(shù)的進(jìn)展 目前納米產(chǎn)品在動物營養(yǎng)領(lǐng)域的基礎(chǔ)性研究甚少，如不同納米營養(yǎng)素的適宜需要量，吸收時有無相互作用，對理化指標(biāo)和功能基因的表達(dá)有無影響等，這些問題尚未得到充分的研究3。此外，各種納米飼料，納米添加劑，納米畜產(chǎn)品，納米食品的安全性研究更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于產(chǎn)品的開發(fā)，它們的安全性歸根到底是關(guān)系到人民身體健康的丈事，必須要經(jīng)過嚴(yán)格的評價和監(jiān)控，防患于來然。如不立刻加強(qiáng)這些方面的研究，不能及時給消費(fèi)者一個明確可靠的說法。納米營養(yǎng)素的進(jìn)一步開發(fā)將困難重重，納米飼料、納米功能食品的產(chǎn)業(yè)化就無法形成規(guī)模4。1.3 乳酸菌的生物學(xué)特征及其性質(zhì)乳酸菌屬于原核類生物中的一類

12、異養(yǎng)厭氧型或兼性厭氧型細(xì)菌，利用可發(fā)酵碳水化合物( 主要是葡萄糖或乳糖) 產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性菌的總稱，廣泛存在于人和禽的腸道中, 能維持機(jī)體內(nèi)多種微生物菌群之間的平衡，與人類的健康息息相關(guān)。1.3.1 乳酸菌的分類 從形態(tài)上分，乳酸菌可以分為球狀、桿狀鏈狀、分支狀三大類。如圓形或卵圓形的 和腸膜明串珠菌、分支狀的雙歧乳桿菌、四聯(lián)狀的乳酸片球菌。現(xiàn)在國際上普遍采取的是Bergey氏細(xì)菌鑒定手冊中乳酸細(xì)菌的分類方法，凌代文5將乳酸細(xì)菌分成四大類：革蘭氏陽性無芽孢桿菌、形成內(nèi)生芽孢的桿菌、革蘭氏陽性兼性厭氧球菌、不規(guī)則形的專性厭氧菌。1.3.2 細(xì)菌生物膜的特性 細(xì)菌生物膜是一種附著于細(xì)菌體表

13、或界面由細(xì)菌群體和包裹菌體的水合性基質(zhì)組成的聚合體6，生物膜成熟后可以釋放游離菌體。與普通游離細(xì)菌相比，生物膜細(xì)菌和生物膜釋放細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗逆性。由于生物膜細(xì)菌在生理、代謝、對底物的降解或利用和對環(huán)境的抵抗能力等方面具有獨(dú)特的性質(zhì)7-9，生物膜的研究近年來備受重視。 細(xì)菌生物膜已在多個領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用，如環(huán)境修復(fù)工程和能源產(chǎn)業(yè)。然而，關(guān)于乳酸菌生物膜方面的研究和應(yīng)用還相對較少，Speranza10等研究利用乳酸菌生物膜來控制軟質(zhì)干酪中李斯特氏菌的生長，Rangaswamy11等研究過利用德氏乳桿菌保加利亞亞種生物膜來連續(xù)生產(chǎn)乳酸。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌是益生菌典型代表，廣泛應(yīng)用于工業(yè)

14、生產(chǎn)，利用其生物膜或生物膜釋放菌體進(jìn)行生產(chǎn)，既可以獲取優(yōu)良菌體又可以節(jié)約發(fā)酵劑，提高經(jīng)濟(jì)效益。1.3.3 飼用乳酸菌微生物制劑 隨著微生態(tài)學(xué)的不斷發(fā)展，在飼料中添加微生物制劑在養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛的認(rèn)可和使用。乳酸菌微生態(tài)制劑是微生物制劑的一種,指將乳酸菌培養(yǎng)后,用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ瞥蓭Щ罹姆蹌?、片劑或丸劑等，具有整腸和防治腸胃疾病以及重新建立正常的腸道菌群平衡的作用。 孫笑非12等研究了乳酸菌在飼料中的運(yùn)用，他指出微生物制劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，不僅可以作為免疫增強(qiáng)劑加強(qiáng)免疫機(jī)能，也能作為生長促進(jìn)劑提高質(zhì)量和成活率等生產(chǎn)性能。 楊琛杰13等總結(jié)了乳酸菌在微生態(tài)制劑上的研究, 添加了微生態(tài)制劑的飼料，產(chǎn)生

15、不飽和脂肪酸和芳香酸, 使飼料產(chǎn)生香味，刺激家禽的食欲；微生物能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，促進(jìn)食物中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高了家禽對氮素的利用率。同時微生態(tài)制劑具有促進(jìn)消化、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等特點(diǎn)。因此，乳酸菌作為微生物制劑在未來的養(yǎng)殖業(yè)中具有一定的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。1.4 納米氧化鋅的合成1.4.1 納米氧化鋅的無機(jī)合成 目前，納米氧化鋅的工業(yè)化生產(chǎn)方法很多，如沉淀法等，但這些傳統(tǒng)方法多為高溫高耗能，對環(huán)境破壞大 14 。而最近幾年來，生物方法制備納米材料得到了一定的發(fā)展，如 DNA分子、蛋白質(zhì)、微生物、動物和植物體15 等被用來制備納米材料，Sangeetha 等用蘆薈提取物成功

16、合成納米氧化鋅材料16 。 王娜等用蛋殼薄膜作為生物活性載體，設(shè)計(jì)了一種在有生物活性材料參與的條件下室溫原位合成硒化鉛納米團(tuán)簇的新方法。該方法利用蛋膜上特定周期性分布的大分子與無機(jī)前驅(qū)體離子之間的螯合作用和電荷作用來控制硒化鉛微晶的形成、聚集和分布，成功地制備出了具有規(guī)則形狀的硒化鉛納米團(tuán)簇 17 。1.4.2 納米氧化鋅的生物合成 細(xì)菌生物膜無所不在。隨著人們對其認(rèn)識的加深，各種針對生物膜的研究也相應(yīng)展開。納米材料技術(shù)就是其中之一。然而，在各類細(xì)菌疾病盛行的今天，絕大部分的工作者都執(zhí)著于如何更有效地滅殺生物膜而忽視了生物膜自身的各種特性。生物膜是一種具有復(fù)雜化學(xué)成分，獨(dú)特生物活性以及精致微米

17、/納米結(jié)構(gòu)的特殊材料。 細(xì)菌具有極高的比表面積，以及雙向的鉆附能力。因此，納米陣列會優(yōu)在細(xì)菌的表面上生長，可以利用這一特性實(shí)現(xiàn)納米陣列在復(fù)雜基底表面的固定和傳導(dǎo)。我們利用乳酸菌的私附能力，實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜基底內(nèi)壁中，致密氧化鋅陣列的成核、固定與生長18。1.4.3 納米氧化鋅的抑菌 納米ZnO顆粒（1100 nm）尺寸較小，比表面積較大，表現(xiàn)出非常高的化學(xué)活性、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面與界面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，在陶瓷、化工、電子、光學(xué)、生物、醫(yī)藥等許多領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值19 。由于納米氧化鋅的性能穩(wěn)定可靠、安全無毒以及無需紫外照射就能表現(xiàn)出良好的抑菌活力，在抗菌方面的應(yīng)用更為廣泛20，因

18、此制備高質(zhì)量的納米ZnO非常重要。 喻兵權(quán)21權(quán)等人實(shí)驗(yàn)證明，在日光燈照射下，無論是對大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌，納米氧化鋅比普通氧化鋅有更好的抑菌作用。當(dāng)納米氧化鋅和普通氧化鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為5%條件下，對大腸桿菌的抑菌率分別達(dá)到97.9%和52.9%；對金黃色葡萄球菌抑菌率分別達(dá)到98.8%和68.3%.研究表明，在5分鐘內(nèi)，納米氧化鋅對金黃色葡萄球菌的殺菌率為98.86%，大腸桿菌為99.93%，顯著高于普通氧化鋅。1.4.4 納米氧化鋅在飼料中應(yīng)用 納米氧化鋅不僅在光化學(xué)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用，在食品以及動物飼料中也發(fā)揮很大作用22 。目前豬場養(yǎng)殖發(fā)現(xiàn)高鋅能有效防止斷奶豬仔的腹瀉問題。將納米氧化

19、鋅替代普通鋅源，添加在動物飼養(yǎng)中，其高生物活性、對腸道致病菌的抗菌性23 和吸收率可以有效地減少腹瀉，降低料肉比，而且劑量更少，對環(huán)境污染小，為人類健康造福，是目前代替高鋅最理想的飼料添加劑 24，在飼料行業(yè)的應(yīng)用前景廣闊。 胡文鋒25等提供了一種利用乳酸菌生物合成納米氧化鋅的方法及納米氧化鋅復(fù)合飼料添加劑。本發(fā)明利用乳酸菌合成納米級氧化鋅后可開發(fā)一種全新的富含納米氧化鋅的飼料添加劑。這種添加劑應(yīng)用于乳豬飼料中，添加量低于1000ppm（以氧化鋅計(jì)）26。因此除有效防止動物鋅中毒，減少鋅對環(huán)境的污染之外，還能通過乳酸菌和氧化鋅的共同作用，有效防止斷奶豬仔的腹瀉，改善腸道健康水平，甚至可以全部或

20、部分替代抗生素，減少抗生素殘留，提高食品安全性能。1.5 本課題的要求、目的及意義 納米氧化鋅具有抗菌效應(yīng)。本研究的任務(wù)是利用益生性乳酸菌作為反應(yīng)介質(zhì)，以生物方法制備納米氧化鋅。目的是得到納米氧化鋅和乳酸菌的混合物，并進(jìn)一步對該混合物進(jìn)行干燥、與載體混合，制備成為含有益生菌及納米氧化鋅復(fù)合功能成分的飼料添加劑。在生物技術(shù)和納米技術(shù)之間突破新的領(lǐng)域。2 材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)菌種 唾液乳桿菌Lactobacillus salivarius,大腸桿菌 Escherichia coli和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus等均由中北大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏。2.2 實(shí)驗(yàn)儀

21、器與藥品2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 見附錄A2.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品 見附錄B2.3 試劑配制及滅菌2.3.1試劑及培養(yǎng)基配制(均是配制1000毫升所需） MRS培養(yǎng)基配制：稱取蛋白胨10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏5.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫80 1.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂 0.58g、硫酸錳 0.25g、瓊脂 18.0g（固體培養(yǎng)基所加），加蒸餾水至1000 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.5左右。在121的高溫高壓鍋中滅菌15min。LB培養(yǎng)基配制：蛋白胨10g、酵母菌粉5g、氯化鈉10g、瓊脂15g（固體培養(yǎng)基所加），加入1000ml蒸餾水，調(diào)節(jié)

22、pH值至7.2左右。在121的高溫高壓鍋中滅菌15min。0.1g/mL 氫氧化鈉溶液配制：稱取10g固體氫氧化鈉，緩慢加入到100mL蒸餾水中，并不斷攪拌，充分溶解。硫酸鋅溶液配制：稱取11.27g硫酸鋅固體，緩慢加入到200mL蒸餾水中，并不斷攪拌，充分溶解。2.4 實(shí)驗(yàn)方法2.4.1 菌種活化 將實(shí)驗(yàn)室保藏的唾液乳桿菌按2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)24小時，待菌液pH達(dá)到4.5左右，鏡檢，若視野范圍內(nèi)觀察到大量紫色桿狀菌株，表明其活化完成。同理，將實(shí)驗(yàn)室保藏的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌按2%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)24小時，可觀察到培養(yǎng)基變渾濁，有菌種產(chǎn)生。然后保

23、存到冰箱中，待用。2.4.2 制備納米氧化鋅 制備納米氧化鋅工藝流程：唾液乳酸桿菌的培養(yǎng)加硫酸鋅調(diào)節(jié)pH值 水浴加熱37培養(yǎng)箱靜置納米氧化鋅產(chǎn)品 具體操作步驟如下： 將所需要以及滅菌完成的儀器和試劑放到超凈工作臺中，有燒杯、量筒、離心管、pH試紙、玻璃棒、硫酸鋅溶液、氫氧化鈉溶液等。然后打開超凈工作臺中的紫外經(jīng)行滅菌，滅菌15min。滅菌完成后，關(guān)掉紫外，并將培養(yǎng)的唾液乳酸桿菌放入到超凈工作臺中。用酒精對我們的手進(jìn)行殺菌，點(diǎn)燃酒精燈。然后用量筒量取一定的菌液轉(zhuǎn)入到燒杯中，在量取等量的硫酸鋅溶液緩慢加入到燒杯中，并不斷攪拌，使兩者充分混合。測出混合溶液的pH，一般都小于5，加入氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)

24、pH至5.5，取兩支離心管，每支試管倒入10毫升混合液，并標(biāo)記。依次類推。pH為6.5時，取28支離心管，每支試管倒入10毫升混合液，并標(biāo)記。然后對離心管水浴加熱。打開水浴鍋。當(dāng)溫度為45時，取兩支裝有混合物pH為6.5的離心管放入水浴加熱25min，依次類推。溫度為75時，取裝有混合物pH值不同的離心管全部水浴加熱25min；且其中10支pH為6.5的離心管，水浴加熱時間分別為5、15、25、35、45min。完成水浴加熱后，將全部離心管放入到37的培養(yǎng)箱中陳化9小時。制得反應(yīng)沉淀（納米氧化鋅粗品）。陳化完成后，得到反應(yīng)液全液。將部分反應(yīng)全液在3500rpm離心20min。分別得到反應(yīng)液上清

25、與沉淀。將試管放到烘干箱中在100下烘4個小時，得到干燥的沉淀物。并對其經(jīng)行稱量，測出物質(zhì)的干重。然后對其進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)測定。2.4.3 納米氧化鋅的制備工藝2.4.3.1 不同水浴溫度下納米氧化鋅的制備 在pH為6.5和水浴時間為25min的條件下，將水浴溫度分為45、55、65、75、85五組，制備納米氧化鋅。如表2.1所示。 表2.1 不同水浴溫度下納米氧化鋅的制備組別條件溫度/培養(yǎng)狀態(tài)組1菌液+硫酸鋅溶液45靜置組2菌液+硫酸鋅溶液55靜置組3菌液+硫酸鋅溶液65靜置組4菌液+硫酸鋅溶液75靜置組5菌液+硫酸鋅溶液85靜置2.4.3.2 不同水浴時間下納米氧化鋅的制備 在pH為6.5和水

26、浴溫度為75條件下，將水浴時間分為5min、15min2、5min、35min、45min五組，制備納米氧化鋅。如表2.2所示。 表2.2 不同水浴時間下納米氧化鋅的制備組別條件時間/min培養(yǎng)狀態(tài)組1菌液+硫酸鋅溶液5靜置組2菌液+硫酸鋅溶液15靜置組3菌液+硫酸鋅溶液25靜置組4菌液+硫酸鋅溶液35靜置組5菌液+硫酸鋅溶液45靜置2.4.3.3 不同pH下納米氧化鋅的制備 在水浴溫度為75和水浴時間為25min的條件下，將pH分為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5五組，制備納米氧化鋅。如表2.3所示。 表2.3 不同pH下納米氧化鋅的制備 組別條件pH培養(yǎng)狀態(tài)組1菌液+硫酸鋅溶液5.5

27、靜置組2菌液+硫酸鋅溶液6.0靜置組3菌液+硫酸鋅溶液6.5靜置組4菌液+硫酸鋅溶液7.0靜置組5菌液+硫酸鋅溶液7.5靜置2.4.4 反應(yīng)液中菌體活性測定 在超凈工作臺中，取15個無菌干燥的培養(yǎng)皿，用MRS進(jìn)行涂板。然后將各組的反應(yīng)液用移液槍吸取100L，分別打入培養(yǎng)皿的中央，然后用滅菌的玻璃棒進(jìn)行涂勻，并標(biāo)記。再將涂好的培養(yǎng)皿放在37的培養(yǎng)箱經(jīng)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時候觀察有無菌種生長。2.5 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的抑菌效果測定2.5.1 大腸桿菌抑菌圈的測定方法 在超凈工作臺中，將滅菌完成后的LB培養(yǎng)基分別倒在培養(yǎng)皿中，等其冷卻并凝固。再將我們所培養(yǎng)的大腸桿菌從冷藏冰箱中取出，以無菌水稀釋至合

28、適濃度，用移液器吸取50L打入涂滿LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在用無菌玻璃棒涂板到LB瓊脂平板上，邊涂邊旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使其充分涂勻。再用滅菌過的打孔器在培養(yǎng)皿中打孔。將步驟2.5中得到的納米氧化鋅反應(yīng)沉淀用500L無菌蒸餾水溶解，充分?jǐn)嚢韬蠡靹虻贸恋碇貞乙?，用移液槍吸取并打入到涂布了大腸桿菌平板的孔中，每個孔打入沉淀重懸液10L。晾干后將平板放入到37的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16個小時，測定抑菌圈的直徑，按下式測定單位抑菌比。 單位抑菌比=抑菌圈直徑/重懸液濃度 （2-1）2.5.2 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌生長性能的影響 取16支滅菌試管，每只管裝入10mL的LB培養(yǎng)基，以無菌方式接入20L大腸桿菌菌液，搖勻。然后

29、用移液槍吸取2.6.1中的沉淀重懸液50L，打入到其中15支試管中，搖勻并標(biāo)記。另外一支試管不加納米氧化鋅沉淀重懸液，為大腸桿菌自然生長狀態(tài)的對照組。測定各組試管中剛接種時的初始OD值，每組測三次，取平均值。將所有試管放到37搖床中，培養(yǎng)24小時，取樣測定OD值，每組測三次，取平均值。得到各組培養(yǎng)前后OD值的增長值，按下式測定沉淀重懸液的抑菌率和單位抑菌率。 抑菌率=（對照組OD值-試驗(yàn)組OD值）/對照組OD值×100% （2-2） 單位抑菌率=抑菌率/單位菌液中納米氧化鋅的量 （2-3）2.6 反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌生長性能的影響 取16支滅菌試管，每只管裝入10mL的LB培養(yǎng)基

30、，以無菌方式接入20L金黃色葡萄球菌菌液，搖勻。然后用移液槍吸取2.6.1中的沉淀重懸液50L，打入到其中15支試管中，搖勻并標(biāo)記。另外一支試管不加納米氧化鋅沉淀重懸液，為大腸桿菌自然生長狀態(tài)的對照組。測定各組試管中剛接種時的初始OD值，每組測三次，取平均值。 將所有試管放到37搖床中，培養(yǎng)24小時，取樣測定OD值，每組測三次，取平均值。得到各組培養(yǎng)前后OD值的增長值，按公式2.6中測定沉淀重懸液的抑菌率和單位抑菌率。注：實(shí)驗(yàn)完后，在倒菌液之前向其中加入有殺菌效果的試劑，比如氫氧化鈉之類的，因?yàn)槠湟讚]發(fā)，而且對人有嚴(yán)重的危害。2.7數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，

31、采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的多重比較,顯著水平取0.05。3 結(jié)果與分析3.1 不同制備條件下沉淀產(chǎn)物的得率3.1.1 水浴溫度對反應(yīng)沉淀質(zhì)量影響及分析得率以產(chǎn)品離心后的反應(yīng)沉淀質(zhì)量來計(jì)。取5支干燥的離心管，稱其總重量為25.36g，平均每支試管質(zhì)量為5.07g。 X=25.36/5=5.07g 當(dāng)pH為6.5，水浴時間為25min時，不同水浴溫度下得到沉淀物質(zhì)量如表3.1所示。 表3.1 水浴溫度對反應(yīng)沉淀質(zhì)量的影響（單位g)溫度/4555657585管15.505.455.415.625.51管25.525.505.435.575.49平均5.51a5.48a5.42a5.60a5.50a

32、沉淀0.440.410.350.530.43SD0.01414210.03535530.014142130.03535530.0141421 由表3.1可以看出，在pH和水浴時間一定時，隨水浴溫度的增加，沉淀量有差異，水浴溫度為75時，反應(yīng)產(chǎn)物量最大；水浴溫度為55時反應(yīng)產(chǎn)物量最小。經(jīng)成對t檢驗(yàn)，二者不存在顯著差異（P=0.06）。因此，水浴溫度對反應(yīng)沉淀的質(zhì)量沒有顯著影響?？紤]到水浴溫度75時產(chǎn)量最大，所以選用75作為最適溫度。3.1.2 水浴時間對反應(yīng)沉淀質(zhì)量的影響及分析 當(dāng)pH為6.5，水浴溫度為75時，不同水浴時間下得到反應(yīng)沉淀質(zhì)量如表3.2所示。 表3.2 水浴時間對反應(yīng)沉淀質(zhì)量的影

33、響（單位g)時間/min515253545管15.555.575.545.615.50管25.565.545.595.495.52平均5.55a5.56a5.57a5.55a5.51a沉淀0.480.490.500.480.44SD0.00707100.02121320.03535530.08485280.0141421 由表3.2可以看出，在pH和水浴溫度一定時，隨著水浴時間的增加，反應(yīng)沉淀質(zhì)量有差異，水浴時間為25min時,反應(yīng)沉淀量最大；水浴時間為45min時，反應(yīng)沉淀量最小。經(jīng)成對t檢驗(yàn)，二者不存在顯著差異（P=0.08）。因此，水浴時間對反應(yīng)沉淀質(zhì)量沒有顯著影響。綜合考慮實(shí)驗(yàn)效果，取

34、時間為25min為最適水浴時間。3.1.3 pH對反應(yīng)沉淀質(zhì)量的影響及分析當(dāng)水浴溫度為75，水浴時間為25min時，不同pH下得到反應(yīng)沉淀質(zhì)量如表3.3所示。 表3.3 pH值對反應(yīng)沉淀質(zhì)量影響（單位g) pH5.56.06.57.07.5管15.485.515.565.706.17管25.455.565.595.586.01平均5.47b5.53a5.57a5.59a6.09a沉淀0.400.480.500.521.02SD0.02121320.03535530.02121320.08485280.1131370 由表3.3可以看出，在水浴溫度和水浴時間一定的條件下，隨著pH值的增大，反應(yīng)沉

35、淀有差異，反應(yīng)沉淀最大的pH為7.5，最小的pH為5.5。多重檢驗(yàn)比較，pH對沉淀量產(chǎn)生顯著影響（P=0.03）。因此pH的大小對反應(yīng)產(chǎn)物沉淀有顯著影響。而對pH為7.5和pH為6.0；pH為7.0和pH為5.5分別經(jīng)行成對t檢驗(yàn)，求得都不存在顯著性差異（P1=0.59；P2=0.08）。所以pH為7.5時，pH過大，影響了反應(yīng)條件，生成不明沉淀，綜合比較，試驗(yàn)選用pH值為6.5。氧化鋅屬于水不溶性物質(zhì)，而在反應(yīng)初期加入的硫酸鋅屬于水溶性物質(zhì)，因此，本實(shí)驗(yàn)中制得的納米氧化鋅主要存在于反應(yīng)沉淀中，但是沉淀中除包含目標(biāo)物質(zhì)納米氧化鋅外，應(yīng)該還包含乳酸菌菌體以及培養(yǎng)基中殘留的部分未溶解部分，因此，這

36、一反應(yīng)產(chǎn)物只是氧化鋅的粗品。納米氧化鋅的主要功能在于其對致病菌的抑菌功能。下面的研究關(guān)注1）反應(yīng)產(chǎn)物中乳酸菌菌體的活性；2）納米氧化鋅粗品的抑菌性能。3.2 反應(yīng)液菌體活性測定 為了檢測反應(yīng)中唾液乳酸菌的活性，對包含菌體的反應(yīng)液進(jìn)行了乳酸菌活菌檢測試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)所有15個樣品的反應(yīng)液在MRS培養(yǎng)基中37培養(yǎng)24h，均無菌落生成。說明反應(yīng)后唾液乳酸桿菌均無活性，分析其原因可能如下： （1）水浴溫度為45以上，乳酸菌不耐高溫被殺死； （2）反應(yīng)底物硫酸鋅本身有殺菌功能，唾液乳酸桿菌被高濃度硫酸鋅殺死； （3）反應(yīng)完成后生成納米氧化鋅，其本身有抑菌效果，導(dǎo)致菌種完全無法生長。 唾液乳桿菌在反應(yīng)后沒有任何

37、活性，其在反應(yīng)中的作用可能是為納米氧化鋅的生成提供反應(yīng)界面，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。3.3 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌抑菌效果測定與分析 反應(yīng)完成后以硫酸鋅為對照，對反應(yīng)全液、反應(yīng)上清液進(jìn)行抑菌能力測定，發(fā)現(xiàn)上清液及反應(yīng)全液均能在大腸桿菌平皿上產(chǎn)生抑菌圈，但是抑菌圈與同濃度的硫酸鋅相比沒有顯著差異?？紤]到硫酸鋅為水溶性物質(zhì)，而反應(yīng)中添加的硫酸鋅為過量添加，因此上清液和反應(yīng)全液中的抑菌能力有很大一部分為硫酸鋅的抑菌效果。氧化鋅為水不溶性物質(zhì)，因此，納米氧化鋅主要存在于反應(yīng)物沉淀中。因此對沉淀進(jìn)行抑菌效果分析。3.3.1 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的抑菌圈的影響 對鋪滿大腸桿菌的培養(yǎng)皿中分別打入2.6中得到的15

38、組不同的納米氧化鋅重懸液，經(jīng)24小時的培養(yǎng)后，得到不同大小的抑菌圈，如表3.4所示。 表3.4 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的抑菌圈（mm） 條件1組2組3組4組5組溫度時間PH 不同條件下得到反應(yīng)沉淀對大腸桿菌抑菌圈進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析處理,并對兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，利用公式2-1算出單位抑菌比，如表3.5、3.6、3.7所示。 表3.5 不同水浴溫度下制取氧化鋅對大腸桿菌抑菌圈直徑的影響（mm）溫度/4555657585重懸液濃度g/mL0.880.820.701.060.86內(nèi)徑3.703.823.853.723.77外徑8.049.047.928.537.83抑菌直徑4.345.224.074.074

39、.06單位抑菌比mm/ mg·mL-14.936.365.813.844.72 表3.7 不同水浴時間下制取氧化鋅對大腸桿菌抑菌圈直徑的影響（mm）時間/min515253545重懸液濃度g/mL0.960.981.000.960.88內(nèi)徑3.374.093.553.934.01外徑10.8010.3110.1810.3110.41抑菌直徑7.436.226.636.386.40單位抑菌比mm/ mg·mL-17.346.356.636.647.27 表3.7 不同pH下制取氧化鋅對大腸桿菌抑菌圈直徑的影響（mm）pH5.56.06.57.07.5重懸液濃度g/mL0.80

40、0.961.001.042.04內(nèi)徑3.703.763.643.733.74外徑8.107.969.749.528.55抑菌直徑4.404.206.105.794.81單位抑菌比mm/ mg·mL-15.504.386.10 5.562.36為了更好觀察不同組分對大腸桿菌的抑菌效果，得出最佳結(jié)論，將各組得到單位抑菌比繪制成折線圖，橫坐標(biāo)為組分，縱坐標(biāo)為單位抑菌比。如圖3.1所示。 圖3.1 不同條件下制取反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的抑菌效果分析：（1）由圖3.1可以看出，不同條件制備的反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的生長活性都有顯著的抑菌效果。(2) 就溫度曲線而言，在pH和水浴時間一定時，隨水浴溫度的

41、變化，單位抑菌比有明顯的變化趨勢，說明不同水浴溫度下制取的反應(yīng)沉淀對大腸桿菌生長活性有明顯的抑菌差異。在水浴溫度為55時，單位抑菌比最大，抑菌效果最好；在水浴溫度為75時，單位抑菌比最小，抑菌效果最差。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，最適水浴溫度應(yīng)為55。(3) 就時間曲線而言，在pH和水浴溫度一定時，隨水浴時間的變化，單位抑菌比變化比較平穩(wěn)，可見不同水浴時間下制取的反應(yīng)沉淀對大腸桿菌生長活性抑菌效果差異不明顯。在水浴時間為5min時，單位抑菌比最大，抑菌效果最好；水浴時間為15min時，單位抑菌比最小，抑菌效果最差。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，最適水浴時間應(yīng)為5min。(4) 就pH曲線而言，在水浴溫度和水浴時

42、間一定時，隨pH的變化，單位抑菌比有明顯的變化趨勢，說明不同pH下制取反應(yīng)沉淀對大腸桿菌生長活性有明顯的抑菌差異。pH為6.5時，單位抑菌比最大，抑菌效果最好；pH為7.0時，單位抑菌比最小，抑菌效果最好。由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，最適pH應(yīng)為6.5。而我們試驗(yàn)中選取的pH是6.5，故比較合理。(5) 在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑菌圈總體而言較小，分析原因可能是由于氧化鋅為水不溶性物質(zhì)，而抑菌圈的擴(kuò)大則要求物質(zhì)溶于水進(jìn)而在培養(yǎng)基中擴(kuò)散。因此，用抑菌圈方法可能不能完全檢測反應(yīng)產(chǎn)物的抑菌能力。下面的實(shí)驗(yàn)將反應(yīng)產(chǎn)物加入含目標(biāo)致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的液體培養(yǎng)基中，測定其對目標(biāo)菌OD 值得影響，以此來反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物

43、的抑菌能力。3.3.2 反應(yīng)沉淀對大腸桿菌生長性能的影響 取16支試管，分別加入10mLLB培養(yǎng)基和20L菌液，前15支試管分別加入2.6中所得納米氧化鋅沉淀重懸液50L進(jìn)行抑菌測定，最后一組空白為不加納米氧化鋅。的空白對照組，測出各組培養(yǎng)前后試管中液體的OD值，每組測三次，取平均值，求出增長值。此處，對照組OD值的增長量為目標(biāo)致病菌大腸桿菌在正常情況下的菌數(shù)增加量，實(shí)驗(yàn)組中目標(biāo)菌的生長受到納米氧化鋅抑菌能力的影響，其OD 增長與對照組相比較小。抑菌率是實(shí)驗(yàn)所得納米氧化鋅對目標(biāo)致病菌抑制能力的指標(biāo)。抑菌率為每組條件制得納米氧化鋅總體對大腸桿菌生長OD 值增長的總抑制效果，單位抑菌率為每毫升大腸

44、桿菌中添加1mg納米氧化鋅粗品后對菌體OD值增長的抑制效果。3.3.2.1 不同水浴時間制備反應(yīng)沉淀對大腸桿菌OD值的影響 在pH和水浴溫度一定條件下，不同水浴時間下測得OD增長值，利用公式2-2和2-3計(jì)算抑菌率和單位抑菌率，如表3.8所示。 表3.8 不同水浴時間制備反應(yīng)沉淀對大腸桿菌OD值的影響時間/min培養(yǎng)前OD均值培養(yǎng)后OD均值增長值抑菌率/%單位抑菌率%/ mg·mL-1差異顯著性（=0.05）50.0970.9210.82420.34.2e150.0850.8970.81221.54.4d250.2130.9420.72929.55.9b350.1610.8640.7

45、5926.65.5c450.1360.7030.70332.07.3a對照組0.0711.1051.034 將上表中單位抑菌率繪制成條形圖，如圖3.2所示。 圖3.2 不同水浴時間制備反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的單位抑菌率 經(jīng)多重比較，可知納米氧化鋅制備保溫時間對大腸桿菌生長活性影響差異顯著。由圖3.2可以看出，在pH和浴熱溫度一定時，浴熱時間為45min時，單位抑菌率最大，抑菌效果最強(qiáng)；浴熱時間為5min時，單位抑菌率最小，抑菌效果最弱。而浴熱時間為45min時相對抑菌效果最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中制得的納米氧化鋅沉淀中除包含目標(biāo)物質(zhì)納米氧化鋅，還包括菌體等其他物質(zhì)。 結(jié)合前面水浴時間對納米氧化鋅沉淀的影響發(fā)現(xiàn)

46、，雖然水浴時間對沉淀的產(chǎn)生沒有顯著影響，但是它對抑菌效率有顯著影響。說明水浴時間越長，沉淀中有效物質(zhì)，即納米氧化鋅的得率越高，從而抑菌功能越強(qiáng)。3.3.2.2 不同pH制備反應(yīng)沉淀對大腸桿菌OD值的影響 在水浴溫度和水浴時間一定下，不同pH下測得OD值，利用公式2-2和2-3計(jì)算抑菌率和單位抑菌率。如表3.9所示。 表3.9 不同pH制備反應(yīng)產(chǎn)物對大腸桿菌OD值的影響pH培養(yǎng)前OD均值培養(yǎng)后OD均值增長值抑菌率%單位抑菌率%/ mg·mL-1差異顯著性（=0.05）5.50.1210.7660.64537.69.4a6.00.0960.7560.66435.88.0d6.50.088

47、0.7040.61640.48.0c7.00.1350.7340.59942.18.1b7.50.0920.6410.52249.54.9e對照組0.0711.1051.034 對上表中單位抑菌率繪制成條形圖，如圖3.3所示。 圖3.3 不同pH制備反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的單位抑菌率 經(jīng)多重比較，可知不同pH條件制備的反應(yīng)產(chǎn)物對大腸桿菌生長活性影響差異極顯著。由圖3.3可以看出，在水浴溫度和水浴時間一定時，pH為5.5時，單位抑菌率最大，抑菌效果最強(qiáng)；pH為7.5時，單位抑菌比最小，抑菌效果最弱。pH為6.5時，相對抑菌能力也比較強(qiáng)。3.3.2.3 不同水浴溫度制備反應(yīng)沉淀對大腸桿菌OD值的影響

48、在pH和水浴時間一定條件下，不同水浴溫度下測得OD值。如表3.10所示。 表3.10 不同水浴溫度制備反應(yīng)產(chǎn)物對大腸桿菌OD值的影響溫度/培養(yǎng)前OD均值培養(yǎng)后OD均值增長值抑菌率/%單位抑菌率% /mg·mL-1差異顯著性（=0.05）450.0770.8020.72529.96.8d550.0790.7120.63538.69.4a650.0850.8490.76426.17.5b750.0880.8350.74727.85.3e850.0810.7810.70032.37.3c對照組0.0711.1051.034 對上表中單位抑菌率繪制成條形圖，如圖3.4所示. 圖3.4 不同水

49、浴溫度制備反應(yīng)沉淀對大腸桿菌的單位抑菌率經(jīng)多重比較，可知不同水浴溫度下制備反應(yīng)沉淀對大腸桿菌生長活性影響差異極顯著。由圖3.3可以看出，pH和水浴時間一定時，水浴溫度為55時，單位抑菌率最大，抑菌效果最強(qiáng)；水浴溫度為75時，單位抑菌比最小，抑菌效果最差。3.4 反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌生長性能的影響3.4.1 不同水浴時間制備的反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌OD值的影響 在pH和水浴溫度一定條件下，不同水浴時間下測得OD增長值。如表3.11所示。 表3.11 不同水浴時間制備反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌OD值的影響時間/min培養(yǎng)前OD均值培養(yǎng)后OD均值增長值抑菌率/%單位抑菌率%/ mg·m

50、L-1差異顯著性（=0.05）50.1960.4970.30159.912.5c150.1770.5160.33954.811.2d250.2030.5190.31657.911.6b350.2420.5030.26165.213.6a450.1910.5060.31558.013.2b對照組0.1370.8870.750 對上表中單位抑菌率繪制成條形圖，如圖3.5所示。 圖3.5 不同水浴時間制備反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌的單位抑菌率 經(jīng)多重比較，可知不同水浴時間下制備的反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌生長活性影響差異極顯著。由圖3.5可以看出，在pH和水浴溫度一定時，水浴時間為35min時，單位抑菌

51、率最大，抑菌效果最好；水浴時間為15min時，單位抑菌率最小，抑菌效果最弱。3.4.2 不同pH制備反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌OD值的影響 在水浴溫度和水浴時間一定下，不同pH下測得OD值。如表3.12所示。 表3.12 不同pH制備反應(yīng)沉淀對金黃色葡萄球菌OD值的影響pH培養(yǎng)前OD均值培養(yǎng)后OD均值增長值抑菌率/%單位抑菌率% /mg·mL-1差異顯著性（=0.05）5.50.2170.5970.38059.814.9a6.00.1860.5350.34953.511.1b6.50.1820.5180.33755.111.0c7.00.2170.5710.35452.810.1d7.50.1700.5840.41444.