木瓜蛋白酶酶活力檢測(cè)方法

1、木瓜蛋白酶酶活力檢測(cè)方法南寧龐博生物工程有限公司企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/NPB 01-2019食品添加劑 木瓜蛋白酶制劑1 、 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品添加劑 木瓜蛋白酶制劑的原輔料要求、技術(shù)要求、試驗(yàn)方法、檢 驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于以木瓜果乳汁為原料，添加葡萄糖，經(jīng)浸泡提取、過(guò)濾、濃縮、干燥、 調(diào)配粉碎、包裝等工藝制成的食品添加劑 木瓜蛋白酶制劑。2 、 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其 隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本 標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期

2、的引用文件，其 最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 191-2019 包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志GB/T 601-2002 化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備 GB/T 602-2002 化學(xué)試劑 雜質(zhì)測(cè)定 用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 GB/T 603-2002 化學(xué)試劑 試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備 GB 2760 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.2-2019食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn) 菌落總數(shù)的測(cè)定 GB/T 4789.3-2019 食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù) GB/T 4789.4-2019 食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn) 沙門氏菌檢測(cè) GB/T 4789.6-2019 食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn) 致瀉大腸埃希氏菌檢測(cè) GB/

3、T 4789.10-2019 食 品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn) GB/T 5009.3-2019 食品中水分的測(cè)定GB/T 5009.74-2019食品添加劑中重金屬限量試驗(yàn) GB/T 5009.75-2019 食品添加劑中鉛的測(cè)定 GB/T 5009.76-2019 食品添加劑中砷的測(cè)定 GB 5749-2019 生活飲用水衛(wèi)生 標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6682-2019 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 GB 7718 預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則GB/T 8170-2019 數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄 糖JJF 1070 定量包裝商品凈含量檢驗(yàn)規(guī)則 NY

4、/T 691-2019 番木瓜定量包裝商品計(jì)量監(jiān)督管理辦法 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局令（ 2019）第 75 號(hào) 3 、 原輔料要求 3.1 水應(yīng)符合 GB 5749-2019 規(guī)定 3.2 木瓜果應(yīng)符合 NY/T 691-2019 的規(guī)定 3.3 葡萄糖應(yīng)符合 GB/T 20880-2019 中無(wú)水葡萄糖的規(guī)定 3.4 食品添加劑食品添加劑使用的品種和使用量應(yīng)符合 GB2760 的規(guī)定，質(zhì)量應(yīng)符合相應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的 規(guī)定。 4 、 技術(shù)要求 4.1 感官應(yīng)符合表 1 的規(guī)定表14.2 理化指標(biāo) 應(yīng)符合表 2 的規(guī)定。4.3 微生物指標(biāo) 應(yīng)符合表 3 規(guī)定。5 、 試驗(yàn)方法 5.1 一般規(guī)定本標(biāo)準(zhǔn)

5、所用試劑和水，在沒(méi)有注明其他要求時(shí)，均指分析純?cè)噭┖?GB/T 6682-2019 中規(guī)定的三級(jí)水；所述溶液如未指明溶劑，均系水溶液；所有滴定分析用標(biāo)準(zhǔn)溶液按 GB/T 601-2002 配制和標(biāo)定；所有雜質(zhì)測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)溶液按 GB/T 601-2002 配制；所有試驗(yàn)方法中 所用制劑和制品按 GB/T 603-2002 配制。 5.2 感官用目測(cè)、鼻嗅、口嘗方法檢查。 5.3 理化指標(biāo) 5.3.1 酶活力的測(cè)定 5.3.1.1 原理 蛋白酶在一定溫度與 PH條件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)， 并使未水解的酪蛋白沉淀除去，濾液對(duì)紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測(cè)定，根據(jù)吸 收度

6、計(jì)算酶活力。 5.3.1.2 酶活力定義在一定的條件下，每分鐘水解酪蛋白生成lug酪氨酸所需的酶的量，為1個(gè)酶活力單位（U）o 5.3.1.3儀器和設(shè)備恒溫水浴（37±0.2 °C）.紫外分光光度計(jì)。 5.3.1.4 試劑和溶液 5.3.1.4.1 酶稀釋液稱取L-半胱氨酸鹽酸鹽（C3N7NO2SHCI H2O=157.635.27g，氯化鈉（NaCI）23.4g，加水500mL溶解，另取乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na22H2O （該物質(zhì)在水 中的溶解度不高，如果沒(méi)有溶解會(huì)使溶液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象）2.23g，加水200mL溶解，合并兩液均勻，用O.1mol/L氫氧化

7、鈉溶液或O.1mol/L鹽酸溶液調(diào)至PH=5.5 （初次配該溶液PH原始值為1.75，需要加0.5mol/L的氫氧化鈉25ml左右調(diào)節(jié)至PH=5.5），加水稀釋至1000mL。 5.3.1.4.2 0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液稱取磷酸氫二鈉（Na2HP04 12H2O 17.89g，加水溶解，并定容至 1000mL （該溶液 使用量為80ml，配制時(shí)可考慮配 100ml） 53143酪蛋白溶液（該溶液配制過(guò)程較快，可以不用提前很久配制。）稱取經(jīng)硅膠干燥器中干燥至恒重的酪蛋白（干酪素，不經(jīng)干燥至恒重仍可做檢測(cè)）0.6g （精確至0.0002g ），置燒杯中，加入 0.05mol/L磷酸氫二鈉

8、溶液 80mL在沸水浴中 邊加熱邊攪拌，直至完全溶解，冷卻后，用0.1mol/L鹽酸調(diào)至PH=7.0 （初次配該溶液，配制好后PH值在7.5左右，需要加鹽酸調(diào)節(jié)，0.1mol/L的鹽酸用量為5ml左右），轉(zhuǎn)移 到100mL容量瓶中，加水至刻度。臨用現(xiàn)配。53144三氯乙酸溶液稱取三氯乙酸（C2HCI3O2 17.99g，加無(wú)水乙酸鈉（CH3COONa29.94g和冰乙酸（CH3COQH18.9mL，加適量水溶解后，加水定容至1000mL,振搖均勻。5.3.1.4.5 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取于105C干燥至恒重的酪氨酸 50mg（精確至0.0002g ），用0.1mol/L鹽酸溶解， 移入100mL

9、容量瓶中，并用0.1mol/L鹽酸定容至刻度，搖勻。吸收1.00mL置10mL容量瓶中，加0.1mol/L鹽酸至刻度，搖勻，即得含酪氨酸50ug/mL的溶液。5.3.1.4.6 試樣溶液（稀釋倍數(shù)為 25000）稱取適量試樣（精確至 0.0002g ）（稀釋倍數(shù)參考表 4）置研體中，加少量酶稀釋液 研磨20min,用酶稀釋液移至250mL容量瓶中，加酶稀釋液至刻度，充分搖勻；根據(jù)不同 品種酶活力高低，吸取適量試樣溶液置于容量瓶中，加酶稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度（稀釋至 試樣溶液吸光度在0.20.6范圍內(nèi)），充分搖勻，供測(cè)試用（60min內(nèi)使用）。表45.3.1.5 測(cè)定步驟吸取試樣溶液1.00mL置

10、于10mL具塞比色管中，于 37C± 0.2 C水浴中保溫10min,加入在37C± 0.2 C水浴中預(yù)熱的酪蛋白溶液5.00mL，搖勻，置37C± 0.2 C水浴中，反應(yīng) 10min,加入在37C± 0.2 C水浴中預(yù)熱的三氯乙酸溶液5.00mL,搖勻，于37C± 0.2 C水浴中放置40min,用干燥濾紙過(guò)濾，取續(xù)濾液，在2h內(nèi)，在波長(zhǎng)為275nm處用蒸餾水作參比測(cè)出濾液的吸光度A1°（可做兩個(gè)平行，第一次測(cè)定兩個(gè)平行值分別為 0.389、0.399）空白試驗(yàn)：吸取試樣溶液 1.00mL置于10mL具塞比色管中，于37C±

11、; 0.2 C水浴中保 溫10mi n,加入在37C± 0.2 C水浴中預(yù)熱的三氯乙酸溶液 5.00mL,搖勻，反應(yīng)10min , 加入在37C± 0.2 C水浴中預(yù)熱的酪蛋白溶液 5.00mL，搖勻，于37C± 0.2 C水浴中放置40min,用干燥濾紙過(guò)濾，取續(xù)濾液，在2h內(nèi)，在波長(zhǎng)為275nm處用蒸餾水作參比測(cè)出濾液的吸光度A2。（初次測(cè)定該值為 0.292）酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度：用蒸餾水作參比，在波長(zhǎng)275nm處測(cè)定50ug/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A3o（初次測(cè)定該值為 0.346）531.6結(jié)果計(jì)算試樣中酶活力X1 （ U/g）按式（1）計(jì)算：X1=

12、式中：A1 試樣溶液的吸光度 A2 空白試樣的吸光度 A3 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度m1 對(duì)照品溶液每毫升中含酪氨酸的量,單位為微克（ug）, （ 1 ）即為 50m2 試樣的質(zhì)量，單位為克（g） n 試樣溶液的稀釋倍數(shù)，即為25000 5.3.1.7允許差二次平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)誤差應(yīng)不大于10%取其算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果。5.3.2 水分的測(cè)定以相同的原材料，同一班次生產(chǎn)的產(chǎn)品為一批。6.2 抽樣按 GB/T 5009.3-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.3.3重金屬按 GB/T 5009.74-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.3.4鉛按 GB/T 5009.75-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.3.5總砷按 GB/T

13、 5009.76-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.4微生物指標(biāo) 5.4.1 菌落總數(shù)按 GB/T 4789.2-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.4.2大腸菌群按 GB/T 4789.3-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.4.3沙門氏菌按 GB/T 4789.4-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.4.4金黃色葡萄球菌按 GB/T 4789.10-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.4.5致瀉大腸埃希氏菌按 GB/T 4789.6-2019的規(guī)定執(zhí)行。5.5 凈含量按JJF 1070的規(guī)定執(zhí)行。6、6.1組批6.2.1 感官、理化及微生物指標(biāo)隨機(jī)從每批 5%以上的包裝箱中抽取樣品，每箱中抽取樣品約10g 左右，試樣總量應(yīng)不小于50g。迅速混勻后

14、分別裝入兩個(gè)清潔干燥的磨口玻璃瓶中，并在標(biāo)簽上注明生產(chǎn)廠名， 產(chǎn)品名稱，批號(hào)，數(shù)量及取樣日期。一瓶作檢驗(yàn)用，一瓶留存?zhèn)洳椤Ｎ⑸餀z驗(yàn)按無(wú)菌操 作取樣。 6.2.2 凈含量按 JJF 1070 及國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局令（ 2019）第 75 號(hào)的規(guī)定進(jìn)行。 6.3 出 廠檢驗(yàn)6.3.1 每批產(chǎn)品均應(yīng)進(jìn)行出廠檢驗(yàn)。6.3.2 出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目為： 4.1 ， 4.2 中酶活力、水分， 4.3 中菌落總數(shù)、大腸菌群，凈 含量。 6.4 型式檢驗(yàn)檢驗(yàn)規(guī)則6.4.1 型式檢驗(yàn)每半年進(jìn)行一次，有下列情況之一時(shí)亦應(yīng)進(jìn)行型式檢驗(yàn)：產(chǎn)品試制、正式投產(chǎn)時(shí)更換設(shè)備或長(zhǎng)期停產(chǎn)再恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)出廠檢驗(yàn)結(jié)果與上次型式檢驗(yàn)結(jié)果

15、有較大差異時(shí) 原料、工藝較大變化，可 能影響產(chǎn)品質(zhì)量時(shí) 衛(wèi)生或質(zhì)量監(jiān)督機(jī)構(gòu)提出要求時(shí) 6.4.2 型式檢驗(yàn)項(xiàng)目為第 4 章全 部要求。 6.5 判定規(guī)則6.5.1 質(zhì)量指標(biāo)合格的判斷，采用 GB/T 8170-2019 中的“修約值比較法”。6.5.2 微生物指標(biāo)及凈含量有一項(xiàng)不符合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，即判定產(chǎn)品為不合格，不復(fù)檢。 其他指標(biāo)若有一項(xiàng)以上（含一項(xiàng)）不符合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，應(yīng)重新從該批產(chǎn)品中抽取兩倍樣品 進(jìn)行復(fù)檢。復(fù)檢結(jié)果全部符合本標(biāo)準(zhǔn)要求時(shí)，產(chǎn)品判為合格。如果復(fù)檢結(jié)果仍有一項(xiàng)不符 合本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則判定為產(chǎn)品不合格。 7 標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存 7.1 標(biāo)志小時(shí)包裝的標(biāo)簽應(yīng)符合 GB 7718的規(guī)定。外包裝儲(chǔ)運(yùn)圖示標(biāo)志應(yīng)符合 GB/T 191-2019 的規(guī)定。 7.2 包裝產(chǎn)品用塑料袋和鋁箔袋包裝，每袋凈含量為 1000g。