《豬血清白蛋白的分》ppt課件

1、 血潔白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占血潔白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占總量的總量的60。 它是一種水溶性很強(qiáng)的蛋白，構(gòu)造穩(wěn)定，能結(jié)合它是一種水溶性很強(qiáng)的蛋白，構(gòu)造穩(wěn)定，能結(jié)合多種小分子，如脂肪酸，膽紅素，血紅素等，起多種小分子，如脂肪酸，膽紅素，血紅素等，起維持血液的正常浸透壓作用。維持血液的正常浸透壓作用。 此外白蛋白還有解毒、參與脂類代謝及血漿中微此外白蛋白還有解毒、參與脂類代謝及血漿中微溶物質(zhì)的運(yùn)輸、維持血液酸堿平衡等作用，在醫(yī)溶物質(zhì)的運(yùn)輸、維持血液酸堿平衡等作用，在醫(yī)學(xué)臨床及生物領(lǐng)域運(yùn)用廣泛學(xué)臨床及生物領(lǐng)域運(yùn)用廣泛 。血清的制備血清的制備 白蛋白的分別白蛋白的分別 白蛋

2、白的純化白蛋白的純化 蛋白質(zhì)含量的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定測(cè)定白蛋白純度的白蛋白純度的檢測(cè)檢測(cè) 白蛋白的相對(duì)分白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定子質(zhì)量的測(cè)定留樣：留樣：2 2，3 3留樣：留樣：4,4,留樣：留樣：1 1量筒量取量筒量取9 ml9 ml底液底液50 %50 %的飽和硫酸銨溶的飽和硫酸銨溶液，用移液管逐滴參與，不斷搖擺。液，用移液管逐滴參與，不斷搖擺。4 4 靜置靜置2 h2 h；4 4 ，13,000 rpm13,000 rpm離心離心20 min20 min，搜集上清，搜集上清，留留0.5 ml0.5 ml樣樣2 2至至1.5 ml1.5 ml離心管，用于測(cè)離心管，用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量和電泳；

3、定蛋白質(zhì)含量和電泳；用用5%的檸檬酸緩沖液調(diào)理的檸檬酸緩沖液調(diào)理pH至至4.5，用量筒確定上清液，用量筒確定上清液的體積，計(jì)算參與飽和硫酸銨的體積，計(jì)算參與飽和硫酸銨pH4.5的體積的體積0.11V；逐滴參與飽和硫酸銨逐滴參與飽和硫酸銨pH4.5，振蕩，振蕩，4 靜置靜置2 h；4 ，3,000 rpm離心離心20 min，棄上清，沉淀用，棄上清，沉淀用0.5 mL pH7.4的檸檬酸緩沖液溶解，置透析袋中，放入的檸檬酸緩沖液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4的檸檬酸緩沖液中，攪拌透析過(guò)夜至蛋白質(zhì)溶液中無(wú)的檸檬酸緩沖液中，攪拌透析過(guò)夜至蛋白質(zhì)溶液中無(wú)NH4存在；留存在；留0.1 ml樣樣3至至

4、1.5 ml離心管，用于測(cè)離心管，用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量和電泳；定蛋白質(zhì)含量和電泳；NH4的檢測(cè)：奈氏試劑的檢測(cè)：奈氏試劑磚紅色的溶液或沉淀磚紅色的溶液或沉淀 在離子交換層析中，蛋白質(zhì)對(duì)離子交換劑的結(jié)在離子交換層析中，蛋白質(zhì)對(duì)離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此之間的靜電吸引。合力取決于彼此之間的靜電吸引。蛋白質(zhì)混合物的分別可以由改動(dòng)溶液中鹽離子蛋白質(zhì)混合物的分別可以由改動(dòng)溶液中鹽離子濃度或濃度或pHpH來(lái)完成，對(duì)離子交換劑結(jié)合力最小的來(lái)完成，對(duì)離子交換劑結(jié)合力最小的蛋白質(zhì)首先從層析柱中洗脫出來(lái)。蛋白質(zhì)首先從層析柱中洗脫出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)采用的本實(shí)驗(yàn)采用的DEAEDEAE纖維素離子交換劑纖維素離子交換劑. .層

5、析洗脫，可以采用堅(jiān)持洗脫液成分不斷層析洗脫，可以采用堅(jiān)持洗脫液成分不斷不變的方式洗脫，也可采用改動(dòng)洗脫的鹽不變的方式洗脫，也可采用改動(dòng)洗脫的鹽濃度和或濃度和或pHpH的方式洗脫，后一種方式的方式洗脫，后一種方式又可以分為兩種：一種是騰躍式的分段改又可以分為兩種：一種是騰躍式的分段改動(dòng)梯度洗脫，另一種是漸進(jìn)式的延續(xù)動(dòng)梯度洗脫，另一種是漸進(jìn)式的延續(xù)改動(dòng)延續(xù)洗脫。改動(dòng)延續(xù)洗脫。DEAE-DEAE-纖維素離子交換層析：纖維素離子交換層析：裝柱：將層析柱垂直固定。將裝柱：將層析柱垂直固定。將DEAE-DEAE-纖維素裝入柱內(nèi)，纖維素裝入柱內(nèi)，至至8-10cm8-10cm高度，平衡過(guò)夜；高度，平衡過(guò)夜；洗

6、脫液流速調(diào)理為洗脫液流速調(diào)理為 1mL/min 1mL/min；上樣：將透析袋剪開(kāi)，用移液管轉(zhuǎn)至層析柱內(nèi)，待樣品上樣：將透析袋剪開(kāi)，用移液管轉(zhuǎn)至層析柱內(nèi)，待樣品進(jìn)入凝膠后再參與少量緩沖液，使樣品完全進(jìn)入膠進(jìn)入凝膠后再參與少量緩沖液，使樣品完全進(jìn)入膠內(nèi)；內(nèi)；洗脫：采用延續(xù)梯度洗脫，用洗脫：采用延續(xù)梯度洗脫，用0.020.021.0mol1.0molL L醋酸醋酸醋酸銨緩沖液醋酸銨緩沖液pH7.4pH7.4進(jìn)展洗脫，搜集；進(jìn)展洗脫，搜集；記錄出現(xiàn)峰值的管號(hào)記錄出現(xiàn)峰值的管號(hào)( (樣品樣品4,)4,)洗脫速度慢，可直接換洗脫速度慢，可直接換B B液液 1.0mol 1.0molL L醋酸醋酸銨醋酸醋

7、酸銨緩沖液緩沖液 電泳遷移率與顆粒的電荷、外形、大小電泳遷移率與顆粒的電荷、外形、大小分子量有關(guān)，如電荷、外形都一樣，分子量有關(guān)，如電荷、外形都一樣，那么電泳遷移率只與分子量有關(guān)。那么電泳遷移率只與分子量有關(guān)。SDSSDS的作用：的作用：1.1.能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)構(gòu)造，強(qiáng)復(fù)原劑巰基乙醇能白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)構(gòu)造，強(qiáng)復(fù)原劑巰基乙醇能使二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)完全變性；使二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)完全變性；2.2.能與變性的能與變性的蛋白質(zhì)按比例結(jié)合，構(gòu)成蛋白質(zhì)按比例結(jié)合，構(gòu)成SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物。SDS-SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的

8、特點(diǎn)：蛋白質(zhì)復(fù)合物的特點(diǎn)：1. 1. 由于結(jié)合大量的由于結(jié)合大量的SDSSDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷形狀；使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷形狀；2.2.復(fù)合物都是橢復(fù)合物都是橢圓棒狀。圓棒狀。因此在進(jìn)展電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于因此在進(jìn)展電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子量大小。分子量大小。測(cè)定各條帶的相對(duì)遷移測(cè)定各條帶的相對(duì)遷移率，根據(jù)知蛋白質(zhì)分子率，根據(jù)知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對(duì)遷移率，量和它們的相對(duì)遷移率，以相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，以相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，lgMW為縱坐標(biāo)作規(guī)范為縱坐標(biāo)作規(guī)范曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率從規(guī)范曲的相對(duì)遷移率從規(guī)范曲線上查出它們的線

9、上查出它們的lgMW，再換算成蛋白質(zhì)分子再換算成蛋白質(zhì)分子量量測(cè)定各條帶的相對(duì)遷移率，根據(jù)知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對(duì)遷移率，以相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)為測(cè)定各條帶的相對(duì)遷移率，根據(jù)知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對(duì)遷移率，以相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)為lgMW為縱坐標(biāo)作規(guī)范曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率從規(guī)范曲線上查出它們的為縱坐標(biāo)作規(guī)范曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率從規(guī)范曲線上查出它們的lgMW，再換算成蛋白質(zhì)分子量，再換算成蛋白質(zhì)分子量在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-BxMW為分子為分子量，量，X

10、為遷移率，為遷移率，k、B均為常數(shù)均為常數(shù)假設(shè)將知分子量的規(guī)范蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)假設(shè)將知分子量的規(guī)范蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條規(guī)范曲線，未知蛋白質(zhì)在一樣數(shù)作圖，可獲得一條規(guī)范曲線，未知蛋白質(zhì)在一樣條件下進(jìn)展電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在規(guī)范條件下進(jìn)展電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在規(guī)范曲線上求得分子量。曲線上求得分子量。規(guī)范蛋白質(zhì)規(guī)范蛋白質(zhì)分子量分子量兔磷酸化酶兔磷酸化酶B97 400牛血潔白蛋白牛血潔白蛋白66 200兔肌動(dòng)蛋白兔肌動(dòng)蛋白43 000牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶31 000胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑20 100雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶14 400編號(hào)編號(hào)溶液稱號(hào)

11、溶液稱號(hào)12%分別膠分別膠4%濃縮膠濃縮膠130% Acr 0.8% Bis2.0ml0.33ml2pH 8.9 Tris -HCIpH 8.9 Tris -HCI1.25ml-3pH 6.7 Tris- HCI-0.63ml410%SDS100ul25ul5TEMED2.5ul2.5ul610%AP50ul12.5ul7H2O1.65ml1.5ml總體積總體積約約5 mL約約2.5 mL電泳：點(diǎn)樣端負(fù)極，恒壓：開(kāi)場(chǎng)電泳：點(diǎn)樣端負(fù)極，恒壓：開(kāi)場(chǎng)80V，待樣品進(jìn)，待樣品進(jìn)入分別膠后入分別膠后120V。電極緩沖液：電極緩沖液：pH 8.3 Tris Gly染色：脫色考馬斯亮蘭染色：脫色考馬斯亮蘭R

12、-250，過(guò)夜。，過(guò)夜。脫色：先用蒸餾水沖洗凝膠，再用脫色液冰醋脫色：先用蒸餾水沖洗凝膠，再用脫色液冰醋酸：蒸餾水：甲醇酸：蒸餾水：甲醇=75：875：50脫色脫色1-3h。規(guī)范蛋白液：規(guī)范蛋白液：50g/ mL；樣；樣1、2、3稀釋稀釋100倍倍樣樣1稀釋稀釋600倍倍10 l6ml；樣；樣2、3稀釋稀釋200倍倍10 l2ml；各峰稀釋各峰稀釋5-10倍倍10 l6mlA A、膠的制備、膠的制備編號(hào)編號(hào)溶液稱號(hào)溶液稱號(hào)12%分別膠分別膠4%濃縮膠濃縮膠130% Acr 0.8% Bis2.0ml0.33ml2pH 8.9 Tris -HCI1.25ml-3pH 6.7 Tris- HCI-0.63ml4TEMED2.5ul2.5ul510%AP50ul12.5ul6H2O1.65ml1.5ml總體積總體積約約5 mL約約2.5 mLB B 加樣：各步驟留樣的樣液；層析后的蛋白峰。加樣：各步驟留樣的樣液；層析后的蛋白峰。樣品的處置：樣品加等量的樣品的處置：樣品加等量的40%40%蔗糖溶液、一滴蔗糖溶液、一滴0.1%0.1%溴酚藍(lán)。溴酚藍(lán)。加樣量：加樣量：20l20l樣品樣品+ 5(.+ 5(.C C 電泳：點(diǎn)樣端負(fù)極，恒壓，開(kāi)場(chǎng)電泳：點(diǎn)樣端負(fù)極，恒壓，開(kāi)場(chǎng)80V8