樹舌靈芝多糖的分離純化及抗氧化活性研究

1、 安徽大學(xué)江淮學(xué)院本科畢業(yè)論文 題目：樹舌靈芝多糖的分離純化及抗氧化活性研究 學(xué)生姓名：張珊 學(xué)號： 01124022 系 別： 理工部 專業(yè)：生物科學(xué) 入學(xué)時(shí)間： 2012 年09 月 導(dǎo)師姓名：吳慶喜 職稱/學(xué)位： 講師 /博士 導(dǎo)師所在單位： 安徽大學(xué)生命科學(xué)院 完成時(shí)間： 2016年04 月 樹舌靈芝多糖的分離純化及抗氧化研究 摘 要目的：研究樹舌靈芝多糖的分離純化及抗氧化作用。方法：利用傳統(tǒng)的水提醇沉的方法得到粗多糖，采用超濾的方法進(jìn)行分離純化，得到單一組分多糖,并從分子量大小,紅外光譜,單糖組成等進(jìn)行簡單的表征分析,進(jìn)一步研究了單一組份多糖對羥自由基，DPPH自由基清除能力。 結(jié)果

2、：分離純化得到單一組分的糖GT-2分子量為5.04×103，紅外光譜分析表明樹舌靈芝多糖GT-2具有典型的多糖吸收峰是-葡萄吡喃糖，單糖組成得到五種單糖的摩爾比為1：3.3: 6.2：14.35：17。結(jié)論：用超濾得到的單一組分的多糖GT-2分子量較小，蛋白質(zhì)含量較少，具有典型的多糖吸收峰，由甘露糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖組成，抗氧化研究表明具有很強(qiáng)的抗氧化能力。關(guān)鍵詞：樹舌靈芝多糖；超濾；抗氧化作用；表征分析 Purification and Antioxidant Activity of Ganoderma lucidum Polysaccharides Isola

3、ted Tree TongueSummaryObjective: To study the water-soluble polysaccharide Purification and antioxidant effects. Methods:The traditional water extraction and alcohol precipitation method obtained crude polysaccharide, were isolated and purified by ultrafiltration method, single component polysacchar

4、ide, and carries on the simple characterization analysis from the size of the molecular weight, infrared spectroscopy, monosaccharide composition, the further study of the single component polysaccharide on hydroxyl radical, DPPH free radical scavenging ability.Result: Separation and purification of

5、 get single group of sugar GT-2 molecular weight is 5.04 x 103 and infrared spectrum analysis showed that Ganoderma applanatum polysaccharide GT-2 is typical of the polysaccharide absorption peak is beta - Grape pyranose and monosaccharide compositions were the molar ratio of five kinds of monosacch

6、aride 1:3.3: 6.2:14.35:17. Conclusion: Obtained by ultrafiltration single group of polysaccharide GT-2 molecular weight smaller, less protein content, with the typical absorption peak of the polysaccharide, composed of mannose, glucuronic acid, glucose, galactose, arabinose, antioxidant research sho

7、w has very strong antioxidant ability.Keywords:Ganodermalucidum;Ultrafiltration;Antioxidant;Characterization and Analysis目錄1 引言1 1.1 樹舌靈芝的研究1 1.2 樹舌靈芝多糖功能活性研究1 1.3 樹舌靈芝多糖的分離純化研究進(jìn)展1 1.4 本課題研究的意義及目的22 材料、試劑和儀器3 2.1 材料3 2.2 試劑3 2.3 儀器設(shè)備33 方法3 3.1 原材料的處理3 3.2 樹舌靈芝多糖的提取3 3.3 樹舌靈芝多糖的分離純化3 3.4 樹舌靈芝多糖單一組分的簡

8、要表征分析3 3.4.1 樹舌靈芝多糖紫外掃描3 3.4.2 單一組分靈芝多糖總糖含量測定4 3.4.3 分子量測定HPLC法4 3.4.4 單糖組成4 3.4.5 紅外光譜4 3.5 樹舌靈芝多糖單一組分的抗氧化研究4 3.5.1 對DPPH清除作用4 3.5.2 對羥基自由基清除作用5 3.6 數(shù)據(jù)處理54 結(jié)果與分析5 4.1 樹舌靈芝多糖含量的測定5 4.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線5 4.2 樹舌靈芝多糖紫外掃描分析6 4.3 分子量測定分析6 4.4 單糖組成分析8 4.5 紅外光譜分析9 4.6 抗氧化作用的研究9 4.6.1 對DPPH清除作用分析10 4.6.2 對羥基自由基清除作

9、用分析115 結(jié)論與展望12主要參考文獻(xiàn)14致 謝151引言1.1樹舌靈芝的研究 靈芝又稱靈芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。根據(jù)我國第一部藥物專著神農(nóng)本草經(jīng)記載：靈芝有紫、赤、青、黃、白、黑六種，性味甘平。靈芝原產(chǎn)于亞洲東部，中國古代認(rèn)為靈芝具有長生不老、起死回生的功效，視為仙草。樹舌靈芝為靈芝科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma Karst)高等真菌，世界廣布種。近年來，隨著樹舌靈芝化學(xué)成分及藥理活性不斷研究樹舌靈芝已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥理研究證明，樹舌靈芝的主要有效成分多糖，三萜類化合物和甾醇類化合物都具有重要的生理

10、活性，樹舌靈芝有效成分作為新藥在臨床應(yīng)用上將占一定的位置1。樹舌靈芝藥用可見于中國藥用真菌圖鑒和長白山植物藥志，其性平，微苦，能抗癌，止痛，清熱，化積，止血，化痰，消炎解毒，臨床多用于治療乙型肝炎，食道癌，肺結(jié)核，神經(jīng)衰弱等，在我國和日本民間作為抗癌藥物應(yīng)用已久2。1.2樹舌靈芝多糖功能活性研究 樹舌靈芝多糖中含有多種化學(xué)成分，國內(nèi)外工作者通過對樹舌靈芝菌絲體和子實(shí)體的深入研究，迄今為止從中分離出了多糖，甾體化合物，三萜類化合物，脂類，有機(jī)酸等1，本課題主要以多糖研究為主。 Nakashima S.等3研究認(rèn)為樹舌靈芝多糖制劑能增強(qiáng)小鼠對蛋白抗原的遲發(fā)過敏性反應(yīng)的誘導(dǎo)作用，同時(shí)能擴(kuò)大T細(xì)胞對I

11、gQ抗體反應(yīng)的記憶范圍。（提高免疫力） 于英君等4研究表明樹舌靈芝多糖GF對脾細(xì)胞增殖作用有一定的量效關(guān)系，一定濃度下GF對產(chǎn)生IgM的抗體生成的細(xì)胞數(shù)有抑制作用，但較環(huán)磷酰胺弱。GF對脾臟的重量有增加作用說明GF有刺激脾臟細(xì)胞增殖作用，從一定意義上來說樹舌靈芝多糖GF有改善免疫系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的作用。 高斌等5研究表明，樹舌靈芝多糖（經(jīng)鑒定總糖含量為97.8%，屬于葡聚糖）在體外可協(xié)同ConA激活T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)協(xié)同ConA誘導(dǎo)Th細(xì)胞產(chǎn)生IL-,-IFN。在體內(nèi)可增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)。增強(qiáng)Th細(xì)胞產(chǎn)生-IFN的能力。說明樹舌靈芝多糖在體內(nèi)外均促進(jìn)Th細(xì)胞的功能。（抗腫瘤） 在本實(shí)

12、驗(yàn)室前期的研究中發(fā)現(xiàn)粗多糖的抗氧化活性較高，且多糖組分較復(fù)雜，肯定存在一種有效活性組分多糖。對于尋找這種單一組分的多糖對于樹舌靈芝多糖的研究意義巨大。1.3樹舌靈芝多糖的分離純化研究進(jìn)展 多糖為靈芝屬真菌經(jīng)提取所得到的有效成分之一，受到醫(yī)學(xué)工作者的重視，研究報(bào)道也最多，靈芝多糖一般采用熱水或稀堿提取，提取時(shí)間不宜過長，以防止多糖水解6。 Sasaki T等7采用乙醇和十六烷基三甲基氫氧化銨分布沉淀法，從樹舌靈芝水提取物中分離出一種多糖類物質(zhì)G-Z。將完全酸水解后，能檢測D-葡萄糖以及微量的木質(zhì)糖，該糖經(jīng)鑒定為葡萄糖。我國學(xué)者梁忠?guī)r等8對樹舌多糖結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了深入研究。由CF1脫色得多糖CF1a，

13、并測得其分子量為14萬，研究表明，CF1a有多末端或多16連接，核心結(jié)構(gòu)不被氧化的。 Mizuno .T等9對水提樹舌靈芝總多糖的組成進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果表明樹舌靈芝多糖主要有半纖維素，纖維素，果膠以及溶于低濃度醇的多糖和水溶性多糖組成；將多糖完全酸水解后可得到D-葡萄糖，D-半乳糖，D-甘露糖，L-巖藻糖，L-阿拉伯糖，D-木糖和D-半乳糖醛酸。 許多報(bào)道表明樹舌靈芝多糖采用了不同的分離純化方法，對使用超濾法分離純化的研究較少，本文使用超濾法對樹舌靈芝粗多糖進(jìn)行分離純化。超濾的優(yōu)點(diǎn)有：使用壽命長，產(chǎn)水品質(zhì)高，適用范圍廣，運(yùn)行費(fèi)用低。超濾的機(jī)理是指由膜表面機(jī)械篩分、膜孔阻滯和膜表面及膜孔吸附

14、的綜合效應(yīng)，以篩濾為主。超濾膜篩分過程，以膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動力，以超濾膜為過濾介質(zhì)，在一定的壓力下，當(dāng)原液流過膜表面時(shí)，超濾膜表面密布的許多細(xì)小的微孔只允許水及小分子物質(zhì)通過而成為透過液，而原液中體積大于膜表面微孔徑的物質(zhì)則被截留在膜的進(jìn)液側(cè)，成為濃縮液，因而實(shí)現(xiàn)對原液的凈化、分離和濃縮的目的。1.4本課題研究的目的及意義 本文所用材料是野生樹舌靈芝，從安徽霍山深山采集，長28cm左右寬35cm 左右，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)粗多糖的活性較高，本文對粗多糖采用超濾法進(jìn)行分離純化得到某一低分子量的單一組分的糖。并研究此低分子量單一組分的糖的抗氧化活性。并且對單一組分的簡單結(jié)構(gòu)表征與活性進(jìn)行研究為后期構(gòu)效關(guān)

15、系深一步研究奠定基礎(chǔ)。 圖一：野生樹舌靈芝Figure 1: Wild Ganoderma lucidum Ganoderma lucidum2材料、試劑和儀器2.1材料野生靈芝于2016年2月在安徽霍山獲得，經(jīng)安徽大學(xué)沈業(yè)壽教授鑒定為樹舌靈芝。2.2試劑1. 無水乙醇：上海振業(yè)化工有限公司2. 三氯甲烷：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司3. 正丁醇：上海申博化工有限公司4. DPPH：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司5. 甲醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司6. Vc：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所7. 硫酸亞鐵：無錫市展望化工試劑有限公司8. 水楊酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司9. 雙氧水：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有

16、限公司2.3儀器設(shè)備（1）電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司（3）DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司（4）臺式離心機(jī)：德國Heraeus公司（5）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司（6）TD5A-WS臺式低速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司（7）冷凍干燥機(jī)：德國CHRIST生產(chǎn)（9）冰箱：榮事達(dá)（10）烘箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 (11) 紫外可見分光光度計(jì) 瑞典Pharmacia Biotech（12） TU-1901雙光束紫外可見光光度計(jì) 普析公司3方法3.1 原材料的處理 取一小塊樹舌靈芝，用打碎機(jī)將其打碎呈粉末狀，用保鮮袋分裝存放于4冰箱中。3.2樹舌靈芝

17、粗多糖的提取取靈芝粉末熱水法浸提多糖過濾去除濾渣收集上清液上清液濃縮濃縮液中加乙醇沉淀離心收集沉淀加水復(fù)溶除蛋白（三氯甲烷：正丁醇）透析冷凍干燥得粗多糖3.3樹舌靈芝粗多糖的分離純化采用超濾的方法，使用分子量為5000的超濾膜收集超出來的溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮冷凍干燥，得到單一組分的多糖將其命名為GT-2,放在干燥皿中保存?zhèn)溆谩?.4樹舌靈芝多糖的單一組分簡要表征分析3.4.1樹舌靈芝多糖紫外掃描配置1mg/mL的樹舌靈芝粗多糖溶液,用TU-1901雙光束紫外可見光光度計(jì)在200-700nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。3.4.2單一組分靈芝多糖總糖含量測定苯酚硫酸法測總糖含量，用葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣

18、品得到的吸光值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖含量。1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作使用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖配制1 mg/mL的葡萄糖溶液100 mL；（2）分別取出0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖溶液放于各個試管中,隨后用純水補(bǔ)至1mL；（3）依次吸取1 mL 6%的苯酚溶液和5.0 mL的濃硫酸,將其震蕩混勻,室溫放置15 min；（4）利用紫外分光光度計(jì)測吸光度(0D),測定波長為490 nm,純水為空白組調(diào)零,記錄各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖的吸光值；（5）設(shè)定三組平行實(shí)驗(yàn),取其平均值。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法:橫坐標(biāo)為多糖含量,0D值為縱坐

19、標(biāo)。2）樣品糖含量測定（1）吸取適當(dāng)濃度分離純化后的樹舌靈芝多糖樣品溶液1.0mL, J加入去離子水1.0mL，使其在490nm的吸光值在0.5-1.0之間適宜。（2）按上述步驟操作，紫外分光光度計(jì)490nm測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到相應(yīng)的樣品糖含量。總糖（%）= （樣品糖含量/所取樣品總重量）×100%3.4.3分子量測定（HPLC法） 用高效液相色譜法分析提取的樹舌靈芝多糖中有多少種不同的組分以及各不同組分的分子量的大小。利用高效液相色譜法測定樹舌靈芝多糖的分子量和純度，精確稱取樹舌靈芝多糖樣品，配制成一定的濃度。準(zhǔn)確配制2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖2000、DextranT

20、-10、DextranT-40、DextranT-70、DextranT-100標(biāo)準(zhǔn)溶液，高效液相色譜（HPLC）結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）測定標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。以橫坐標(biāo)為保留時(shí)間t，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖分子量的自然對數(shù)logMW9，繪制相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。微孔過濾膜過濾，上樣量為10 L，使用UItrahydrogelTM 1000 色譜柱（300×7.8 mm）,柱溫設(shè)定為30 oC，流動相使用超純水，流速設(shè)定為1.0 mL/min，漂移管溫度110，物化溫度30，氮?dú)饬魉?.6 L/min。3.4.4單糖組成 采用高效液相色譜法對樹舌靈芝多糖GT-2中單糖組成進(jìn)行分析。精

21、確稱取樹舌靈芝多糖GT-2（10 mg）溶于5 mL的2 mol/L的三氟乙酸（TFA）中，充氮?dú)夥夤?，?10 下水解8 h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于50 將所得溶液濃縮以及除去過量酸，直到所得水解產(chǎn)物是中性的。之后，所獲得的中性水解產(chǎn)物中加入1mL蒸餾水，并準(zhǔn)備用于以下的實(shí)驗(yàn)。單糖的PMP柱前衍生化進(jìn)行根據(jù)文獻(xiàn)8適當(dāng)修改。標(biāo)準(zhǔn)單糖和經(jīng)水解的樣品與混合50 L甲醇的PMP（0.5 mol/L）和50 L的氫氧化鈉（0.3 mol/L）在70 oC水浴鍋中水域30 min。將反應(yīng)混合物用50 L的0.3 mol/L的HCl中和到中性。所得產(chǎn)物用HPLC結(jié)合紫外檢測器進(jìn)行分析。HPLC的操作條件如下：流動

22、相A為磷酸鹽緩沖液的混合物（50 mmol/L） - 乙腈（85：15，V/V）,流動相B為磷酸鹽緩沖液的混合物（50 mmol/ L）-乙腈（60：40，V/V），使用梯度洗脫，流動相B的梯度為15%-23%-15%，與此同時(shí)，時(shí)間梯度為0-20-35 min。柱溫為25 ，色譜柱為Zorbox Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 m），檢測器波長為245 nm，進(jìn)樣量為10 L。3.4.5紅外光譜 采用KBr壓片法對分離純化得到的樹舌靈芝多糖GT-2的紅外光譜分子結(jié)構(gòu)分析。稱取預(yù)先干燥好的光譜純KBr，壓成薄片作為空白對照調(diào)整基線。稱取1-2 mg樹

23、舌靈芝多糖GT-2和100-200 mg KBr在研缽里研磨均勻，用壓片機(jī)壓成薄片，在4000-400 cm-1的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行測定。3.5 樹舌靈芝多糖的抗氧化研究以下實(shí)驗(yàn)均同時(shí)設(shè)立VC為陽性對照。本實(shí)驗(yàn)將樹舌靈芝粗多糖和單一組分的多糖GT-2的母液濃度配置成400g/ml，設(shè)定的多種濃度梯度為：25 g/ml，50 g/ml，100 g/ml，200g/ml，300 g/ml，400 g/ml，然后分別取相同體積的不同濃度梯度的多糖，可以達(dá)到設(shè)定濃度梯度的目的。3.5.1對DPPH清除作用 （ 1）原理： 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，是一種暗紫色的大棱柱形晶體,能穩(wěn)定存在

24、于有機(jī)溶劑中，在517nm下具有吸光值。在DPPH自由基與抗氧化劑的反應(yīng)過程中，自由基的顏色會由深變淺，吸光值大小也會逐漸的減少，按照清除率公式的計(jì)算方法，吸收值減少的越多清除率就越高，代表其抗氧化能力越強(qiáng)，因此對DPPH的清除作用可以作為鑒定其抗氧化能力的指標(biāo)。（2）方法：用95%的乙醇配制2 mmol/L的DPPH溶液,取11支具塞試管(10 mL)，在l0 mL試管中加入2 mLDPPH和2 mL一定濃度(0.1 mg/mL-5.0 mg/mL)的多糖溶液,混合均勻后，黑暗中室溫反應(yīng)30 min, 517 nm比色測吸光值，Vc做陽性對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。利用下列公式計(jì)算其清除率：清除率

25、(%) =A0-（A1-A2）/A0 ×100A1 =2 mLDPPH+2 mL多糖溶液；A2=2 mL多糖溶液+2mL去離子水；A0 =2mLDPPH+2mL去離子水。其中A0是對照組吸光值，A1是實(shí)驗(yàn)組吸光值，A2是樣品本底吸光值。按照上式計(jì)算出多糖對DPPH的清除率，清除率越大抗氧化能力越大。3.5.2 對羥基自由基的清除作用（ 1）原理：Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生OH ，反應(yīng)式如下H2O2+Fe2+OH-+OH-+Fe3+ 羥自由基氧化水楊酸得到2,3二羥基苯甲酸，用其在510nm 處的吸光值表示OH 的多少。吸光值與OH的量成正比。反應(yīng)體系中加入具有清除OH 作用的物質(zhì)即可降低

26、該吸光值。羥基自由基是生物體內(nèi)最活'潑,最具有攻擊性、毒性最大的自由基,對人體的危害很大,是細(xì)胞壞死或者發(fā)生突變的原因之一。因此,以對羥基自由基清除率為評價(jià)多糖的抗氧化能力也具有重要的意義。（2）方法：取10 mL具塞試管，各加入9 mmol/L FeS04 1 mL, 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，加入一定濃度(0.l mg/mL-5.0 mg/mL)的多糖溶液2 mL，最后加入8.8 mmol/LH2O2 2 mL啟動反應(yīng)，水浴3730 min，在510 nm波長比色測吸光值，Vc做陽性對照，記錄數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并以下列公式計(jì)算多糖對羥基自由基的清除率：清除率(%)

27、 =A0-（A1-A2）/A0 ×100A0為空白對照以去離子水代替多糖溶液，A1是實(shí)驗(yàn)組吸光值，A2用去離子水代替H2O2作樣品的本底比色吸光值。3.6數(shù)據(jù)處理每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)定三個平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果求平均值。利用Origin 7.5繪圖。4結(jié)果與分析4.1樹舌靈芝多糖含量測定4.1.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作根據(jù)數(shù)據(jù)得到下圖圖2：苯酚-硫酸法測定總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2: phenol - sulfuric acid method for determination of total sugar content of standard curve以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖為參照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2，葡萄

28、糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到公式：y=0.0133x+0.0015，當(dāng)y=1.308時(shí)，x=98.23，總糖（%）= （樣品糖含量/所取樣品總重量）×100%所以多糖含量為：98.23。4.2樹舌靈芝多糖紫外掃描 圖3： 樹舌靈芝多糖GT-2紫外掃描圖譜 Figure.3：Ultraviolet scanning of Ganoderma lucidum polysaccharides GT-2 將樹舌靈芝多糖在200-700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，由圖2可知，樹舌靈芝多糖在260 nm處吸收峰不明顯，因此可以得出樹舌靈芝多糖中幾乎無核酸存在；多糖在400 nm處無吸收峰，因此

29、可以得出樹舌靈芝多糖中蛋白質(zhì)含量也是微乎其微的。4.3分子量測定分析 我們根據(jù)已知分子量的葡聚糖繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：圖中R²=0.99194，y=-0.76054x+11.426。圖 4：樹舌靈芝多糖GT-2的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線 Figure 4：Molecular weight standard curve of Ganoderma lucidum polysaccharides GT-2 圖 5：樹舌靈芝多糖GT-2高效液相色譜圖 Figure. 5：High performance liquid chromatogram of Ganoderma lucidum polysacch

30、arides GT-2樹舌靈芝多糖經(jīng)HPLC檢測，如圖5所示，峰形為單一對稱峰，可見樹舌靈芝多糖是純度較好的多糖樣品，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了保證。將保留時(shí)間帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樹舌靈芝多糖的分子量為5.04×103Da4.4單糖組成分析圖6：樹舌靈芝多糖GT-2的單糖組成圖譜Figure. 6：Composition of GT-2 from Ganoderma lucidum and Ganoderma lucidum polysaccharides注：從圖中可以定性和定量分析出GT-2的單糖組成和單糖的比例。A代表的是溶劑峰，B代表的是甘露糖，C代表的是葡萄糖醛酸，D代表的是葡萄糖，E

31、代表的是半乳糖，F(xiàn)代表的是阿拉伯糖?？梢钥吹紾T-2中總共有5種單糖，阿拉伯糖較少。阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：葡萄糖醛酸：甘露糖的摩爾比為 1：3.3: 6.2：14.35：17。4.5紅外光譜分析用紅外光譜儀繪圖如下：圖7：樹舌靈芝多糖GT-2傅里葉紅外光譜分析圖譜 Figure. 7：Ganoderma lucidum polysaccharides GT-2 Fourier transform infrared spectroscopy analysis由圖7可知，樹舌靈芝多糖GT-2具有典型的多糖吸收峰。在3400-3300cm-1帶出現(xiàn)O-H鍵的伸縮振動，吸收帶寬而圓滑，這是由于分子

32、間締合成氫鍵的原因，締合體越多，吸收帶越向低頻率方向移動。2925cm-1處代表了糖類物質(zhì)的C-H鍵的伸縮振動。1643cm-1處是多糖和水的混合物所特有的吸收峰。1413cm-1和1024cm-1處是C-H鍵的變角振動峰。在578cm-1處出現(xiàn)吸收峰，代表-D-Glc吡喃構(gòu)型的端C-H的變形振動特征吸收峰，說明樣品是-葡萄吡喃糖。4.6 抗氧化作用的研究4.6.1 對DPPH清除作用分析在波長為517nm時(shí)，比色，再根據(jù)清除率公式計(jì)算，繪圖如下：圖8：樹舌靈芝多糖GT-2對自由基的清除Figure8: Ganoderma lucidum polysaccharides GT-2 on DPP

33、H scavenging 從圖8中可以看出：在25g/mL-400 g/mL濃度范圍內(nèi)陽性對照組Vc對DPPH自由基的清除率隨著濃度的遞增而增加，清除效果明顯，清除率保持在93%左右，最高清除率為93.4%。樹舌靈芝粗多糖對DPPH自由基的清除率隨著濃度的遞增不斷的增加，清除效果較明顯。并且，很容易看出：在相同濃度下，Vc的清除率總是高于樹舌靈芝粗多糖的清除率，即相同濃度條件下，Vc的清除作用更明顯。而單一組分的多糖GT-2的清除率也位于較高水平，其濃度為400 ug/mL時(shí)最高清除率為90%，清除率介于樹舌靈芝粗多糖和Vc之間，清除效率也較為明顯。說明樹舌靈芝多糖GT-2對DPPH自由基的清

34、除作用較明顯。4.6.2對羥基自由基清除作用分析在波長為510nm時(shí)，比色，再根據(jù)清除率公式計(jì)算，繪圖如下：圖9：樹舌靈芝多糖GT-2對羥自由基的清除 Figure 9： Ganoderma lucidum polysaccharides GT-2 on OH scavenging從圖9中可以看出：陽性對照組VC對羥自由基的清除率隨著濃度的遞增，也不斷的增大，清除效果明顯，當(dāng)濃度為100g/mL-400g/mL之間清除率保持在92%左右。并且，很容易看出：在相同濃度下，Vc的清除率總是高于單一組分的多糖GT-2和樹舌靈芝粗多糖的清除率，即相同濃度條件下，Vc的清除作用更明顯。而樹舌靈芝粗多糖的

35、清除率始終位于低水平，其最高清除率才只有32.4%，說明在此濃度下，樹舌靈芝粗多糖對羥自由基的清除作用不明顯。單一組分的多糖GT-2的清除率也隨著濃度的增加不斷增加，說明單一組分的多糖GT-2的清除效果明顯。5 結(jié)論與展望在超濾法分離純化樹舌靈芝多糖的過程中得到單一組分的糖再測定這個單一組分的糖活性發(fā)現(xiàn)糖活性較高，綜合整個實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及最終結(jié)果來看，本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)上還存在一些缺陷，比如稱量的過程、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的過程難免有誤差存在，超濾法也存在一定的缺點(diǎn)比如降低了出水壓力和流量；去除水堿、水垢的功能較弱；在高硬度(170mg/L以上)水質(zhì)的地方不宜單獨(dú)使用。在這些方面還要不斷加強(qiáng)改進(jìn)，才能為下次實(shí)驗(yàn)做好

36、鋪墊，得出更加理想的效果。此外，通過抗氧化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，作為陽性對照的VC具有十分高效的自由基清除率，抗氧化性非常高,樹舌靈芝多糖GT-2對DPPH的清除作用也較強(qiáng)，抗氧化性較高。單一組分的糖也具有十分高效的自由基清除率。除此之外，在人體外的確存在一些物質(zhì)，它們能夠在體外抗自由基。對這些體外抗氧化的物質(zhì)進(jìn)行發(fā)現(xiàn)與研究，將會為體內(nèi)抗氧化的進(jìn)一步研究利用有著基礎(chǔ)意義。在目前如何有效地利用樹舌靈芝多糖在藥理上的價(jià)值。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樹舌靈芝多糖具有抗氧化活性，并且在一定程度上能夠有效的清除自由基，是一種新的體外抗氧化的物質(zhì)，具有很廣闊的研究前景。相信隨著對樹舌靈芝多糖的進(jìn)一步研究和認(rèn)識，人類能夠得到更多更可靠的關(guān)于抗氧化方面的信息，在藥用，食品和化妝品上多有很大功效，并以此來增強(qiáng)人類體質(zhì)，治療多種由自由基所引發(fā)的疾病，從而為人類健康服務(wù)。主要參考文獻(xiàn)1劉英杰。樹舌靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體化學(xué)成分研究:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，s646.901 ，10193.2馬述清。樹舌靈芝部分提