生物制藥工藝學(xué)第12章制備型HPLCppt課件

1、第十二章第十二章 制備型高效液相色譜制備型高效液相色譜制備型高效液相色譜的用途：制備型高效液相色譜的用途：v1重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝優(yōu)化、中試以及大規(guī)重組蛋白藥物生產(chǎn)的工藝優(yōu)化、中試以及大規(guī)模生產(chǎn)的必備手段。模生產(chǎn)的必備手段。v2天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的重要手段天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的重要手段: 蛋白蛋白質(zhì)質(zhì),多肽多肽,多糖。抗菌肽多糖?？咕膙3從天然產(chǎn)物來源藥品生產(chǎn)的重要手段：胰島從天然產(chǎn)物來源藥品生產(chǎn)的重要手段：胰島素，蘄蛇酶。素，蘄蛇酶。v4實驗室制備樣品用于臨床試驗和報批。實驗室制備樣品用于臨床試驗和報批。v5 在在 2-D 電泳電泳, blotting, ELISA 等之前的樣等之

2、前的樣品制備。品制備。第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜法簡介高效液相色譜法簡介1.1 1.1 液相色譜的發(fā)展史液相色譜的發(fā)展史 19031903年，色譜法問世。年，色譜法問世。俄國植物學(xué)家茨維特俄國植物學(xué)家茨維特 19031903年年3 3月月2121日，日，大會報告大會報告 “ “一種新型一種新型吸附現(xiàn)象及其在生化吸附現(xiàn)象及其在生化分析上的應(yīng)用分析上的應(yīng)用” 1906” 1906年年在德國植物學(xué)雜志發(fā)表在德國植物學(xué)雜志發(fā)表文章，首次命名上述分文章，首次命名上述分離后色帶為色譜圖，稱此方法為色譜法離后色帶為色譜圖，稱此方法為色譜法 v19311931年，庫恩年，庫恩KuhnKuhn分離胡蘿卜素，分離

3、胡蘿卜素，19381938年，年，KuhnKuhn和和LedererLederer從維生素從維生素B B中分離出中分離出B6B6，獲得了獲得了19381938年的諾貝爾化學(xué)獎。年的諾貝爾化學(xué)獎。v19411941年，馬丁年，馬丁MartinMartin和辛格和辛格SyngeSynge提提出液液分配色譜法，出液液分配色譜法，19521952年度的諾貝爾獎。年度的諾貝爾獎。v6060年代末，年代末，7070年代初，高效液相色譜儀的成功研制年代初，高效液相色譜儀的成功研制v高效填料，高壓泵，儀器檢測高效填料，高壓泵，儀器檢測1.2 基本儀器裝置基本儀器裝置v輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)v進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)v分離系

4、統(tǒng)分離系統(tǒng)v檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)v收集系統(tǒng)收集系統(tǒng)v數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2 1 高效液相色譜儀組成高效液相色譜儀組成1 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng) (1) 高壓輸液泵高壓輸液泵作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。作用：將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。(2)在線脫氣裝置作用：脫去流動相中的溶解氣體。流動相先經(jīng)過脫氣 裝置再輸送到色譜柱。超聲脫氣、真空脫氣等脫氣不好時有氣泡，導(dǎo)致流動相流速不穩(wěn)定，造成脫氣不好時有氣泡，導(dǎo)致流動相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加?；€飄移，噪音增加。Pr

5、essure Dampers O2, N2, CO2（3梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置Isocratic elution恒定組成的單一溶劑體系恒定組成的單一溶劑體系Gradient elution以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，目的是分離多組容量因子相差較大的組分目的是分離多組容量因子相差較大的組分High-Pressure Mixing2 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)六通閥六通閥3 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)3.1色譜柱色譜柱 3.2色譜柱填色譜柱填料料spherical and irregular silica particles Macroporous spherical sil

6、ica particle. K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979 基質(zhì)：載體或擔(dān)體。數(shù)基質(zhì)：載體或擔(dān)體。數(shù)mm數(shù)十?dāng)?shù)十m m，球形。，球形。 硅膠或有機(jī)高分子聚合物硅膠或有機(jī)高分子聚合物Pellicular particlePorous particle30-50m1-2m3-10m 3.3色譜柱填料色譜柱填料功能層：物理吸附或化學(xué)鍵合功能層：物理吸附或化學(xué)鍵合v檢測系統(tǒng)：檢測系統(tǒng)： v收集系統(tǒng)：收集系統(tǒng)：v數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：三、高效液相色譜法的特點三、高效液相色譜法的特點v采用高效色譜柱、高壓輸液設(shè)備和高靈敏度檢測器采用高效色譜柱、高壓輸

7、液設(shè)備和高靈敏度檢測器, , 從而實現(xiàn)了高效、高速、高靈敏度和定量準(zhǔn)確。從而實現(xiàn)了高效、高速、高靈敏度和定量準(zhǔn)確。v和經(jīng)典液相相比有以下優(yōu)點：快速、靈敏度高、分和經(jīng)典液相相比有以下優(yōu)點：快速、靈敏度高、分辨率高、自動化程度高辨率高、自動化程度高 等。等。四、制備型高效液相色譜與分析型高四、制備型高效液相色譜與分析型高效液相色譜法的區(qū)別效液相色譜法的區(qū)別 v輸液泵不同：輸液泵不同： 兩種泵設(shè)計的特點及其性能兩種泵設(shè)計的特點及其性能AKTA prime AKTA purifier AKTA xpress 系統(tǒng)泵及樣品泵 泵型：單泵 流速： 0.1-50ml/min 泵壓： 1Mpa 增量 : 0.

8、1ml/min 粘度： 10cp 泵型：雙泵 4 泵頭高效柱塞泵 流速0.001-10ml/min 泵壓： 25Mpa 流速精度k1，則，則k2/k1，所以，所以又稱為相對保留時間又稱為相對保留時間（美國藥典）。要使兩組分得到分離，必須使（美國藥典）。要使兩組分得到分離，必須使1。與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，質(zhì)上來說，的大小表示兩組份在兩相間的平衡分的大小表示兩組份在兩相間的平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。配熱力學(xué)性質(zhì)的差異，即分

9、子間相互作用力的差異。12kkv分離度：在色譜過程中表示兩組分相互分離的程度分離度：在色譜過程中表示兩組分相互分離的程度, ,一般情況下一般情況下, ,分離度大于分離度大于1.51.5時稱分離完全時稱分離完全. .v 只有峰窄而間距大的分離是令人滿意的。只有峰窄而間距大的分離是令人滿意的。v 在色譜分析中要求：在色譜分析中要求：v 兩組分的保留值差別要足夠大。兩組分的保留值差別要足夠大。 v 兩色譜峰要足夠窄。兩色譜峰要足夠窄。 v 待測組分的分離度要足夠大，分離過程要盡可能待測組分的分離度要足夠大，分離過程要盡可能短短. .2121)(2)(211212WWttWWttRrrrr六、制備型高

10、效液相色譜的重要參數(shù)：六、制備型高效液相色譜的重要參數(shù)：Capacity:Capacity:純化過程中，目標(biāo)物質(zhì)的上樣量。可以純化過程中，目標(biāo)物質(zhì)的上樣量?？梢允求w積也可以是質(zhì)量。是體積也可以是質(zhì)量。Speed:Speed:在除去蛋白酶的過程中此項非常關(guān)鍵。在除去蛋白酶的過程中此項非常關(guān)鍵。Recovery:Recovery:產(chǎn)品貴重時此項很重要。流動相的條件、產(chǎn)品貴重時此項很重要。流動相的條件、環(huán)境會影響它。減少步鄹和保持一種對生物樣品環(huán)境會影響它。減少步鄹和保持一種對生物樣品合適的環(huán)境條件。合適的環(huán)境條件。Resolution:Resolution:在純化的最后階段，此項很關(guān)鍵，尤在純化的

11、最后階段，此項很關(guān)鍵，尤其是雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和目的物結(jié)構(gòu)相似時。其是雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和目的物結(jié)構(gòu)相似時。七、分離機(jī)理和色譜類型七、分離機(jī)理和色譜類型 分離蛋白質(zhì)類物質(zhì)時的分離依據(jù)：分離蛋白質(zhì)類物質(zhì)時的分離依據(jù)：疏水性疏水性分子大小分子大小等電點等電點結(jié)構(gòu)特異性結(jié)構(gòu)特異性色譜介質(zhì)按分離機(jī)理分為色譜介質(zhì)按分離機(jī)理分為正相色譜：正相色譜：反相色譜：常加入反相色譜：常加入TFA離子交換色譜：陰離子交換色譜離子交換色譜：陰離子交換色譜DEAE二乙基二乙基氨基乙基，氨基乙基，Q季胺鹽陽離子交換色譜季胺鹽陽離子交換色譜CM羧甲基羧甲基S磺酸基）磺酸基）凝膠過濾色譜：凝膠過濾色譜：疏水色譜：苯基，辛基等。疏水色譜：苯基，

12、辛基等。金屬螯合色譜：鎳、銅等金屬螯合色譜：鎳、銅等親合色譜親合色譜 : 第二節(jié)第二節(jié) 分離方案的設(shè)計分離方案的設(shè)計vWhat is the intended use of the product?vWhat kind of starting material is available and how should it be handled?vWhat are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product?vWhat has to be removed?vW

13、hat must be removed completely?vWhat will be the final scale of purification?vWhat are the economical constraints and what resources and equipment are available?一、分離方法之間的組合一、分離方法之間的組合 四步純化法：四步純化法：Preparation:Capture:(Isolate,concentrate and stabilize)Intermediate purification:(Remove bulk impurities

14、) Polishing:(Achieve final high level purity）v色譜之間的組合方案色譜之間的組合方案vAC、GF、IEX、HICGFIEXHICACCrude sampleIEXIEXGFxGFGFHICGFGFxGFxGFxSuitable preparation二、分離條件的優(yōu)化二、分離條件的優(yōu)化 合適的溶劑強(qiáng)度合適的溶劑強(qiáng)度:容量因子容量因子k 足夠的柱效足夠的柱效N: 良好的分離選擇性良好的分離選擇性:當(dāng)柱過載時：當(dāng)柱過載時：1 N1 N和和kk都隨樣品負(fù)荷的增加而迅速地減小都隨樣品負(fù)荷的增加而迅速地減小2 2 流速對于塔板數(shù)流速對于塔板數(shù)N N的影響大大地

15、降低的影響大大地降低 3 3 通過增加柱長來有效地提高柱效，不宜通過通過增加柱長來有效地提高柱效，不宜通過降低柱壓或流速來達(dá)此目的降低柱壓或流速來達(dá)此目的 制備分離的兩種途徑： 第一種，基本上同于分析型，進(jìn)樣量不過載，利用大內(nèi)徑的柱，通過調(diào)整分離方程中的有關(guān)參數(shù)來達(dá)到分離的最佳化。在該法中往往利用小顆粒的填料約10m來制取少量價值高而難分離的物質(zhì)。 第二種，使用大粒度填料（50m的大內(nèi)徑柱，在過載情況下制備相對大量的純物質(zhì)。當(dāng)值相當(dāng)大時例如1.2），提高洗脫液的流速并不至于嚴(yán)重降低分離度，從而大大縮短分離時間。 三、制備型高效液相色譜常見問題及解決三、制備型高效液相色譜常見問題及解決辦法辦法v

16、待分離成分呈單一主峰待分離成分呈單一主峰v不易分開的兩組分不易分開的兩組分v目的組分含量少目的組分含量少v待分離成分呈單一主峰待分離成分呈單一主峰v不易分開的兩組分不易分開的兩組分v目的組分含量少目的組分含量少第三節(jié)第三節(jié) 實驗條件的選擇實驗條件的選擇 v色譜柱的選擇與填裝色譜柱的選擇與填裝v柱填料柱填料v流動相選擇流動相選擇v檢測器的選擇檢測器的選擇v儀器設(shè)備儀器設(shè)備一、柱的選擇和裝填 柱：不銹鋼柱： 200kg ，生物適應(yīng)性差玻璃柱：1015kg聚合物柱： 裝填：當(dāng)粒度小于20m，用較大的勻漿罐濕法填裝。粒度大于30m時；利用輕敲柱外壁的干填法二、柱填料 v硅膠：v葡聚糖和瓊脂糖：v高分子

17、聚合物：v顆粒大小v在在很小的分離制備中，要求較高的很小的分離制備中，要求較高的N N值，宜用小值，宜用小粒度的填裝柱。粒度的填裝柱。v當(dāng)當(dāng)很大時，用大顆粒填裝柱，對過載進(jìn)樣是有好很大時，用大顆粒填裝柱，對過載進(jìn)樣是有好處。處。 三、洗脫劑 v可利用相同填料的分析柱，選擇最適合于分離目的可利用相同填料的分析柱，選擇最適合于分離目的和要求的流動相的組成如溶劑的配比，離子強(qiáng)度，和要求的流動相的組成如溶劑的配比，離子強(qiáng)度，pHpH等），將其直接或略加修改后用于制備分離等），將其直接或略加修改后用于制備分離 v一般不采用梯度洗脫一般不采用梯度洗脫 v選擇合適的溶劑溶解樣品選擇合適的溶劑溶解樣品v采用色

18、譜純的試劑采用色譜純的試劑四、儀器設(shè)備v對泵的精密度和準(zhǔn)確度要求不高（ 0.01100mL/min ）v對檢測器的高靈敏要求不高v流路系統(tǒng)盡可能用惰性聚合材料 v柱外效應(yīng)試驗結(jié)果影響較小 第四節(jié)第四節(jié) 操作變量的確定操作變量的確定 一、樣品的進(jìn)樣量一、樣品的進(jìn)樣量宜注射低濃度大體積的樣品，不宜注射高濃度小體積宜注射低濃度大體積的樣品，不宜注射高濃度小體積的樣品。的樣品。樣品進(jìn)樣的體積與柱的內(nèi)徑、柱長、流動相和固定相樣品進(jìn)樣的體積與柱的內(nèi)徑、柱長、流動相和固定相的類型、樣品的溶解性以及分離目的有關(guān)。的類型、樣品的溶解性以及分離目的有關(guān)。柱內(nèi)徑，柱內(nèi)徑，mmmm困難的分離困難的分離1.21.2），

19、），mgmg容易的分離容易的分離1.21.2），），mgmg2 20.20.22 25 525258 81010505010010050050025251001005005001000100050005000二、制備產(chǎn)率 v產(chǎn)率隨分離度的提高而增加。產(chǎn)率隨分離度的提高而增加。v不過載的柱子，不過載的柱子，kk值較小時，產(chǎn)率較高。值較小時，產(chǎn)率較高。v用全孔填料時產(chǎn)率高于用薄殼型的。用全孔填料時產(chǎn)率高于用薄殼型的。v對于對于值小的分離，宜利用小粒度值小的分離，宜利用小粒度5 510m10m填料的柱子；在填料的柱子；在較大時，使用較大顆粒、大內(nèi)徑較大時，使用較大顆粒、大內(nèi)徑的柱，將獲得較高的產(chǎn)率，

20、且價格便宜。的柱，將獲得較高的產(chǎn)率，且價格便宜。v柱的樣品容量和產(chǎn)率隨柱橫截面積的增加而增大。柱的樣品容量和產(chǎn)率隨柱橫截面積的增加而增大。v 產(chǎn)率隨柱長、流動相的流速的增加而增加。產(chǎn)率隨柱長、流動相的流速的增加而增加。 三、回收率計算和純度鑒定v除去組分中的溶劑：熱的氮氣流吹，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去組分中的溶劑：熱的氮氣流吹，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。冷凍干燥。v純度：純度：HPLCHPLC，TCLTCL。v回收率：重量，活性?；厥章剩褐亓浚钚?。v第五節(jié)第五節(jié) 應(yīng)用實例應(yīng)用實例-蛇毒中溶栓組分的分離蛇毒中溶栓組分的分離制備型高效液相色譜的應(yīng)用制備型高效液相色譜的應(yīng)用v肽的分離肽的分離v蛋白質(zhì)的分離

21、蛋白質(zhì)的分離v多糖的分離多糖的分離v核酸的分離核酸的分離 肽的分離：肽的分離： 常用方法為反相色譜和離子交換色譜常用方法為反相色譜和離子交換色譜 肽的保留時間可用氨基酸的保留常數(shù)之和預(yù)肽的保留時間可用氨基酸的保留常數(shù)之和預(yù)測。測。 反相色譜分為：緩沖液反相色譜，離子對反反相色譜分為：緩沖液反相色譜，離子對反相色譜。相色譜。 肽的檢測：肽的檢測：UV200230nm，熒光檢測。，熒光檢測。蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)的分離1 1填料：孔徑填料：孔徑3003005005002 2流動相流動相（1 1pH pH 低低pHpH使蛋白質(zhì)羧基解離受到抑制，使蛋白質(zhì)羧基解離受到抑制，極性降低，與反相鍵合相的作用強(qiáng)。對

22、大極性降低，與反相鍵合相的作用強(qiáng)。對大多蛋白質(zhì)而言，使用多蛋白質(zhì)而言，使用pH2.5pH2.53.53.5的流動相的流動相可以得到最好的分離?？梢缘玫阶詈玫姆蛛x。（2 2離子強(qiáng)度和離子對試劑離子強(qiáng)度和離子對試劑 增加離子強(qiáng)度增加了蛋白質(zhì)與鍵合相的疏水作增加離子強(qiáng)度增加了蛋白質(zhì)與鍵合相的疏水作用，較高的離子強(qiáng)度（用，較高的離子強(qiáng)度（0.20.2可使蛋白質(zhì)有較好可使蛋白質(zhì)有較好的分辨率和回收率。的分辨率和回收率。 緩沖液中的鹽還能通過形成離子對改變蛋白緩沖液中的鹽還能通過形成離子對改變蛋白質(zhì)分子表面極性。反離子是疏水的如三氟乙酸質(zhì)分子表面極性。反離子是疏水的如三氟乙酸根、七氟丁酸根），復(fù)合離子對保留時間增長。根、七氟丁酸根），復(fù)合離子對保留時間增長。如果反離子是親水的如磷酸根、甲酸根），則如果反離子是親水的如磷酸根、甲酸根），則復(fù)合離子對保留時間減少。復(fù)合離子對保留時間減少。 v（3 3有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 v有機(jī)溶劑的選擇是改變蛋白質(zhì)保留性的重要手段之有機(jī)溶劑的選擇是改變蛋白質(zhì)保留性的重要手段之