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1、飼料中真蛋白檢測(cè)方法 1 適用范圍 本操作方法適用配合飼料、濃縮飼料和單一飼料。 2 原理 樣品在水溶液中,加入過量硫酸銅,在堿性條件下,純蛋白被氫氧化銅沉淀, 用水洗去水溶性含氮物,沉淀部分按粗蛋白的測(cè)定方法測(cè)定其含氮量。 3 試劑 3.1 10%硫酸銅溶液: 稱取五水硫酸銅 10g 用水溶解,轉(zhuǎn)移至 100ml 容量瓶中定容至刻度。 3.2 2.5%氫氧化鈉溶液: 稱取 2.5g 氫氧化鈉用水溶解,轉(zhuǎn)移至 100ml 容量瓶中定容至刻度。 3.3 硫酸:化學(xué)純,含量為 98%,無氮。 3.4 催化劑:0.4g 硫酸銅,5 個(gè)結(jié)晶水,6g 硫酸鈉,均為化學(xué)純,磨碎混勻。 3.5 氫氧化鈉:化
2、學(xué)純,40%水溶液(m/v)。 3.5.1 配制方法: 500g 氫氧化鈉+1100ml 蒸餾水。 3.6 硼酸:化學(xué)純,2%水溶液(m/v)。 3.6.1 配制方法: 20.5g 硼酸+1000ml 蒸餾水。 3.7 混合指示劑: 甲基紅,1%乙醇溶液,溴甲酚綠,0.5%乙醇溶液,兩溶液等體積混合,在陰涼處保存期為三個(gè)月。 3.7.1 溴甲酚綠,0.5%乙醇溶液配置: 溴甲酚綠 0.125g+25ml 乙醇。 3.7.2 甲基紅,1%乙醇溶液配置: 甲基紅 0.025g+25ml 乙醇。 3.8 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:鄰苯二甲酸氫鉀法標(biāo)定,按 gb/t601 制備。 3.8.1 0.02mol/l
3、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.67ml 鹽酸,分析純,注入 1000ml 蒸餾水中。 3.8.2 0.1mol/l 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:8.3ml 鹽酸,分析純,注入 1000ml 蒸餾水中。 3.9 硫酸銨:分析純,干燥。 3.10 蔗糖:分析純。 4 儀器設(shè)備 4.1 實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)。 4.2 分樣篩:孔徑 0.45mm(40 目)。 4.3 分析天平:感量 0.0001g。 4.4 電爐。 4.5 滴定管:酸式,25、50ml。 4.6 凱氏燒瓶: 250ml。 4.7 凱氏蒸餾裝置:常量直接蒸餾式或半微量水蒸汽蒸餾式。 4.8 錐形瓶:250ml。 4.9 容量瓶:100ml。 4.10 燒杯:20
4、0ml。 4.11 干燥箱。 5 分析步驟 5.1 半微量法 5.1.1 樣品的處理 稱取待測(cè)樣品 0.5-1g(精確到 0.1mg)于 200ml(4.10)燒杯中,加入 50ml蒸餾水,用玻璃棒攪拌均勻,在電爐(4.4)上加熱煮沸,加入 20ml 10%硫酸銅溶液(3.1),再加入 20ml 2.5%氫氧化鈉溶液(3.2)攪勻,從電爐上取下,在室溫放置 2h,然后用傾瀉法將樣品過濾到濾紙上,用少量溫水多次洗滌燒杯和沉淀物,直至洗出液無硫酸根離子(用 10%氯化鋇溶液來檢驗(yàn)濾液無沉淀),連同漏斗一起放入 80干燥箱(4.11)中烘干,將濾紙和沉淀物小心放入 250ml凱氏燒瓶(4.6)中,加
5、入 6.4g 催化劑(3.4),20ml 濃硫酸(3.3),在電爐(4.4)上消化,樣液澄清后繼續(xù)消煮 2h,取下冷卻后加入 20ml 蒸餾水,轉(zhuǎn)入100ml 容量瓶(4.9)中,冷卻后用水稀釋至刻度,搖勻,做為試樣分解液。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。 5.1.2 蒸餾 將半微量蒸餾裝置(4.7)的冷凝管末端浸入裝有 20ml 硼酸(3.6)的吸收液和 2 滴混合指示劑(3.7)的錐形瓶(4.8)內(nèi)。蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴,硫酸數(shù)滴,在蒸餾過程中保持此液為橙紅色,否則需補(bǔ)加硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液 10-20ml 注入蒸餾裝置中,小心提起玻璃塞使之流入反應(yīng)室,同時(shí)用蒸餾水沖洗蒸餾裝置入口內(nèi)
6、壁使樣品分析液和沖洗液一并流入反應(yīng)室,迅速將玻璃塞塞好,且在入口處加水密封,防止漏氣。蒸餾 4min 降下錐形瓶使冷凝管末端離開液面,再蒸餾 1min,用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液均流入錐形瓶?jī)?nèi),然后停止蒸餾。 5.1.3 滴定 蒸餾后的吸收液立即用 0.02 mol/l 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.8.1)滴定,溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。 5.2 常量法 5.2.1 稱取待測(cè)樣品 0.5-1g(精確到 0.1mg)于 200ml(4.10)燒杯中,加 50ml蒸餾水,用玻璃棒攪拌均勻,在電爐(4.4)上加熱煮沸,加入 20ml10%硫酸銅溶液(3.1),再加入 20ml2.5%氫氧化鈉溶液(3.2
7、)攪勻,從電爐上取下,在室溫放置 2h,然后用傾瀉法將樣品過濾到濾紙上,用少量溫水多次滌燒杯和沉淀物,直至洗出液無硫酸根離子(10%氯化鋇溶液來檢驗(yàn)濾液無沉淀),連同漏斗一起放入 80干燥箱內(nèi)烘干,將濾液和沉淀物小心放入 250ml 凱氏燒瓶(4.6)中,加入 6.4g 催化劑(3.4),20ml 濃硫酸(3.3),在電爐上消化,樣液澄清后繼續(xù)消煮 2h,取下放冷后加入 60-100ml 蒸餾水,搖勻冷卻。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。 5.2.2 將蒸餾裝置(4.7)的冷凝管末浸入裝有 25ml 硼酸(3.6)吸收液和 2 滴混合指示劑(3.7)的錐形瓶?jī)?nèi)。然后小心的向凱氏燒瓶(4.6)中加入 50ml氫
8、氧化鈉溶液,輕輕搖動(dòng)凱氏燒瓶,使溶液混勻后再加熱蒸餾,直至流出液為100ml,降下錐形瓶,使冷凝管末端離開液面,繼續(xù)蒸餾 1-2min,并用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液均需流入錐形瓶?jī)?nèi),然后停止蒸餾。 5.2.3 滴定 蒸餾后的吸收液立即用 0.1mol/l 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.8.2)滴定,溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。 5.3 蒸餾步驟的檢驗(yàn) 精確稱取 0.2g 硫酸銨(3.9)代替試樣,按 5.1 或 5.2 步驟進(jìn)行操作,測(cè)得硫酸銨含氮量為 21.190.2%,否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。 5.4 空白測(cè)定 稱取蔗糖(3.10)0.5g,代替試樣,按 5.1 或 5.2 步驟
9、進(jìn)行空白測(cè)定,消耗0.1mol/l 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.8.2)的體積不得超過 0.2ml。消耗 0.02mol/l 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.8.1)體積不得超過 0.3ml。 6 分析結(jié)果的表述 6.1 計(jì)算見下式: 真蛋白(%)=(v1-v2)c0.01406.25100 mv/v v1-滴定試樣時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,ml; v2-滴定空白時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,ml; c-鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/l; v-試樣分解液的總體積,ml; v-試樣分解液蒸餾用體積,ml; 0.0140-每毫克當(dāng)量氮的克數(shù); 6.25-氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。 6.2 重復(fù)性 每個(gè)試樣取兩個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定,以其算術(shù)平均值為結(jié)果。當(dāng)真蛋白含量在25%以上時(shí),允許相對(duì)偏差為 1%。 當(dāng)真蛋白含量在 10%-25%之間時(shí),允許相對(duì)偏差為 2%。當(dāng)真蛋白含量在 10%以下時(shí),允許相對(duì)偏差為 3%。 7 關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng) 7.1 傾瀉法過濾洗滌時(shí),燒杯中的沉淀物一定要徹底清洗。室溫較低時(shí)洗滌用水的溫度要稍微高一點(diǎn),以保證燒杯中的沉淀物徹底轉(zhuǎn)移。 7.2 過濾時(shí)的濾液達(dá)到 400ml 后再用 10%的氯化鋇溶液檢驗(yàn)濾液是否有沉淀,這樣可以減少檢驗(yàn)次數(shù)。 7.3 烘干沉淀時(shí),可將濾液倒掉,將漏斗和盛放濾液的容器同時(shí)放入干
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