實(shí)驗(yàn)二青霉素酵綜合實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)二 青霉素發(fā)酵綜合實(shí)驗(yàn)（七） 發(fā)酵罐的操作及控制 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)發(fā)酵過程中發(fā)酵控制、取樣、流加等一般操作過程。2、了解和學(xué)習(xí)自動(dòng)發(fā)酵罐的操作過程和注意事項(xiàng)。 實(shí)驗(yàn)原理 一、發(fā)酵控制（一）發(fā)酵溫度的控制1、一般來說，接種后應(yīng)適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度，以利于孢子的萌發(fā)或加快微生物的生長、繁殖， 而且此時(shí)發(fā)酵的溫度大多數(shù)是上升的。 隨著發(fā)酵液的溫度逐漸上升， 發(fā)酵液的溫度應(yīng) 該控制在微生物的最適生長溫度； 到主發(fā)酵旺盛階段溫度的控制可比最適生長溫度低些， 即 控制在微生物代謝產(chǎn)物合成的最適溫度； 到發(fā)酵的后期， 溫度出現(xiàn)下降的趨勢， 直至發(fā)酵成 熟即可放罐。2、工業(yè)發(fā)酵過程一般無須加熱，因?yàn)獒尫诺陌l(fā)

2、酵熱常常超過微生物的最適生長溫度， 所以需要冷卻階段較多。 通常是利用發(fā)酵罐的熱交換裝置進(jìn)行降溫 （如采用夾套或蛇形管進(jìn) 行調(diào)溫），冬季發(fā)酵時(shí)空氣還需進(jìn)行加熱處理，以便維持發(fā)酵的正常溫度。（二）發(fā)酵 pH 值控制 首先應(yīng)根據(jù)不同微生物的特性，不僅要控制原始培養(yǎng)基的 pH 值，而且在整個(gè)發(fā)酵過程 中，必須隨時(shí)檢測 pH 值的變化情況，根據(jù)發(fā)酵過程中的 pH 值變化規(guī)律，選用適當(dāng)?shù)姆椒?對(duì) pH 值進(jìn)行調(diào)節(jié)和控制。在實(shí)際生產(chǎn)中，調(diào)節(jié)和控制 pH 值的方法主要有以下幾種。1、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的原始 pH 值，或加入緩沖溶液（如磷酸鹽）制成緩沖能力強(qiáng)、 pH 值變 化不大的培養(yǎng)基，或使眼淚和碳源的配比平衡。

3、2、在發(fā)酵過程中加入弱酸或弱堿經(jīng)行pH 值調(diào)節(jié)，進(jìn)而合理的控制發(fā)酵條件；也可通過調(diào)整通風(fēng)量來控制 pH 值。3、如果僅用酸或堿調(diào)節(jié) pH 值不能改善發(fā)酵情況時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)料是一個(gè)較好的辦法，它 既可調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH 值，又可補(bǔ)充營養(yǎng)，增加培養(yǎng)液的濃度和減少阻遏作用，進(jìn)一步提高 發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)率。4、采用生理酸性銨鹽作為氮源時(shí)，可在培養(yǎng)液中加入碳酸鈣來調(diào)節(jié)pH 值。但是碳酸鈣的加入量一般都很大， 在操作上很容易引起染菌。 因此， 此方法在發(fā)酵過程中應(yīng)用布氏太廣。5、在發(fā)酵過程中根據(jù) pH 值的變化可用流加氨水的方法來調(diào)節(jié)，同行又可把氨水作為 氮源供給。由于氨水作用快，對(duì)發(fā)酵液的 pH 值影響波動(dòng)大，應(yīng)

4、采用少量多次的流加方法， 以免造成 pH 值過高，從而抑制微生物細(xì)胞的生長，或pH 值過低， NH 4+不足等現(xiàn)象。具體的流加方法應(yīng)根據(jù)微生物的特性、 發(fā)酵過程的菌體生長情況、 耗糖情況等來決定， 一般控制 在pH值7.08.0,最好采用自動(dòng)控制連續(xù)流加方法。6、 以尿素作為氮源經(jīng)行流加調(diào)節(jié)pH 值，是目前國內(nèi)味精廠普遍采用的方法。尿素分 解放出氨，使 pH 值上升；同時(shí)氨和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被微生物利用后形成有機(jī)酸等中間 代謝產(chǎn)物，使 pH 值降低；此時(shí)就需要流加尿素，以調(diào)節(jié) pH 值和補(bǔ)充氮源。反復(fù)進(jìn)行流加 就可維持一定的 pH 值。7、目前已有用于發(fā)酵過程的 pH 測量電極， 可連續(xù)測量

5、并記錄 pH 值的變化， 用于控制 和檢測發(fā)酵 pH 值。（三）提高溶解氧的措施 控制溶解氧的工藝手段主要是從供氧和需氧兩方面來考慮。 影響溶解氧效果的主要因素 有：（1）通氣流量（通風(fēng)量） ；（2）攪拌速度； （3）氣體組分中的氧分壓； （4）罐壓；（5） 溫度；（ 6）溫度；（ 7）培養(yǎng)基的物理性質(zhì)等。而影響需氧的則是菌體的生理特性，諸如不同 菌齡的呼吸強(qiáng)度差別， 基質(zhì)加入時(shí)菌絲耗氧的增加等。 工藝上主要的控制手段有以下幾種方 法。1、改變通氣速率（增大通風(fēng)量）改變通氣速率主要是通過改變體積溶氧系數(shù)KLa來改變供氧能力。有兩種情況：A、在低通氣量的情況下，增大通氣量對(duì)提高溶氧濃度有十分顯著

6、的效果；B、在空氣流速已經(jīng)十分高的情況下， 再增加通氣速率，作用便布氏很明顯，反而會(huì)產(chǎn)生某些副作用，比如泡沫形 成、水分蒸發(fā)、罐溫增加以及染菌幾率增加等。2、改變攪拌速度一般來說，改變攪拌速度的效果要比改變通氣速率大，這是因?yàn)椋篈、通氣泡沫被充分破碎，增加有效氣液接觸面積；B、液流滯流增加，汽泡周圍液膜厚度和菌絲表面液膜厚度減小，并延長了汽泡在液體中的停留時(shí)間，因而就較有效的增加KLa，提高了供氧能力。3、改變氣體組成中的氧分壓用通入純氧的方法來改變空氣中氧的含量，提高了KLa值，因而提供了供氧能力。純氧成本較高， 但對(duì)于某些發(fā)酵，如溶氧低于臨界值時(shí)，短時(shí)間內(nèi)加入純氧是有效而可行的，這 種方法

7、在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)中已被采用。其他富氧裝置也在開發(fā)，但因成本核算問題， 離實(shí)際規(guī)模化應(yīng)用還有距離。4、改變罐壓增加罐壓實(shí)際上就是改變氧的分壓 PO2 來提高液相氧濃度， 從而提高供氧能力， 但此法 不是十分有效。5、改變發(fā)酵液的理化性質(zhì)在發(fā)酵過程中， 菌體本省的繁殖及代謝可引起發(fā)酵液性質(zhì)不斷改變， 例如改變培養(yǎng)液的 表面張力、 粘度及離子強(qiáng)度等， 就會(huì)影響培養(yǎng)液中氣泡的大小、氣泡的溶解性、穩(wěn)定性以及 合并為大氣泡的速率。 同時(shí)發(fā)酵液的性質(zhì)還影響到液體的流動(dòng)及界面或液膜的阻力， 因而顯 著的影響到氧的溶解速度， 而且由于發(fā)酵液中菌絲濃度所引起的表觀粘度的增加， 可使通氣 速率下降。如果培養(yǎng)基

8、性質(zhì)為限制氧傳遞的因素時(shí)， 就根據(jù)具體情況對(duì)培養(yǎng)液的某一物理性質(zhì)稍作 改造， 例如加消泡劑、補(bǔ)加無菌水、 改變培養(yǎng)基成分等都可以改善通氣效果，以適應(yīng)菌的正 常生長。（四）二氧化碳濃度控制1、CO2 在發(fā)酵液中的濃度變化受到許多因素的影響，如細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液的流 變學(xué)特性、通氣攪拌程度；罐壓大小、設(shè)備規(guī)模等。對(duì)CO2 濃度的控制主要看其對(duì)發(fā)酵的影響，如果對(duì)發(fā)酵有促進(jìn)作用，應(yīng)該提高其濃度；反之應(yīng)設(shè)法降低其濃度。2、通過提高通氣量和攪拌速率，在調(diào)節(jié)溶解氧的同時(shí)，還可以調(diào)節(jié)CO2 的濃度，通氣使溶解氧保持在臨界值以上， CO2 又可隨著廢氣排出， 使其維持在引起抑制作用的濃度之下。3、降低通氣量

9、和攪拌速率，有利于提高 CO2 在發(fā)酵液中的濃度。4、C02的產(chǎn)生與補(bǔ)料控制有密切關(guān)系。（五）泡沫的控制1、泡沫產(chǎn)生的原因通氣和攪拌、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基的滅菌方法、培養(yǎng)液的溫度、酸堿度、濃度等對(duì)發(fā)酵 過程的泡沫形成也有一定的影響。2、泡沫的消除和防止了解發(fā)酵過程中泡沫的消長規(guī)律， 方可有效的控制泡沫。 消除和控制泡沫的方法主要包 括化學(xué)消泡和機(jī)械消泡兩種方法， 同行司還可以考慮從減少起泡物質(zhì)和產(chǎn)泡外力著手 （如起 泡物質(zhì)多為表面活性物質(zhì)， 可以適當(dāng)予以減少； 通氣使氧的含量達(dá)到臨界值即可， 不一定要 達(dá)到飽和度） 。（ 1）化學(xué)消泡其優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)消泡劑來源廣泛， 消泡效果好， 作用迅速可靠， 尤

10、其是合成消泡劑的效率 更高，用量少， 不需要改造現(xiàn)有的生產(chǎn)設(shè)備， 不僅適用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)， 同時(shí)也適用于小 規(guī)模的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 這是目前應(yīng)用最廣的一種消泡方法。 工業(yè)上常用的化學(xué)消泡劑種類： 天然 油脂類、高級(jí)醇類、聚醚類（生產(chǎn)上應(yīng)用較多的有聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯氧丙烯甘油等， 它們以一定比例配制的消泡劑又稱 “泡敵”，消泡能力是天然植物油的 10 倍以上）、硅酮類、 氟化烷烴。（ 2）機(jī)械消泡機(jī)械消泡不同于化學(xué)消泡， 它是靠強(qiáng)烈機(jī)械振動(dòng)和壓力的變化， 促使氣泡破裂， 或借助 于機(jī)械力將氣體中排出的液體加以分離回收，從而達(dá)到消泡的作用。A 、罐內(nèi)機(jī)械消泡包括耙式消泡槳的機(jī)械消泡、 旋轉(zhuǎn)圓板式的

11、機(jī)械消泡、 流體吹入式機(jī)械消泡、 沖擊反射 板機(jī)械消泡、超聲波消泡、碟片式消泡器的機(jī)械消泡。B、罐外機(jī)械消泡 包括旋轉(zhuǎn)葉片罐外機(jī)械消泡、轉(zhuǎn)向板消泡、噴霧消泡、離心力消泡、旋風(fēng)分離器消泡。二、抗生素發(fā)酵控制發(fā)酵過程的目的是使微生物大量分泌抗生素。 在發(fā)酵開始前， 有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基也必須 先經(jīng)過滅菌后再接入種子。接種量一般為10%或 10以上，發(fā)酵期視抗生素品種和發(fā)酵工藝而定。在整個(gè)發(fā)酵過程中，需不斷通無菌空氣和攪拌， 以維持一定罐壓或溶氧， 在罐的夾 層或蛇管中需通冷卻水以維持一定罐溫。 此外， 還要加入消泡劑以控制泡沫， 必要時(shí)還加入 酸、堿以調(diào)節(jié)發(fā)酵液的 pH 。對(duì)有的品種在發(fā)酵過程中還需加

12、入葡萄糖、銨鹽或嵌體，以促 進(jìn)抗生素的產(chǎn)生。對(duì)其中一些主要發(fā)酵參數(shù)可以用電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行反饋控制。 在發(fā)酵期間每隔一定時(shí)間應(yīng) 取樣進(jìn)行生化分析、 鏡檢和無菌試驗(yàn)。分析或控制的參數(shù)有菌絲形狀和濃度、殘?zhí)橇俊?氨基 氮、抗生素含量、溶解氧、 pH 、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速和液面控制等。其中有些項(xiàng)目可以通過 在線控制。青霉素發(fā)酵控制具體包括以下幾個(gè)方面。1、加糖控制加糖的控制主要根據(jù)產(chǎn)糖即發(fā)酵過程中的pH，或最好是根據(jù)排氣中 C02及02的量來控制。一般在殘?zhí)橇拷抵?0.6% 左右， pH 上升時(shí)開始加糖。2、補(bǔ)氮及加嵌體補(bǔ)氮是指加硫酸銨、氨或尿素，使發(fā)酵液氨氮控制在0.01%0.05%。補(bǔ)前體以使發(fā)酵液中

13、參與苯乙酰胺濃度為 0.05%0.08%。3、pH 控制對(duì)pH的要求視不同菌種而已，一般為6.46.6?？梢约悠咸烟莵砜刂?pH。當(dāng)前趨勢是加酸或堿自動(dòng)控制 pH。4、溫度控制一般前期為2526C,后期為23C，以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。5、通氣與攪拌抗生素深層培養(yǎng)需要通氣與攪拌， 一般要求發(fā)酵液中溶解氧含量不低于飽和情況下溶解 氧的 30%。通氣比一般為 1：0.8VVM 。攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。6、泡沫與消泡在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫， 可以用天然油脂如豆油、 玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑 “泡 敵”來消泡。應(yīng)當(dāng)控制其用量并少量多次加入，尤其在發(fā)酵前期不宜多用，否則會(huì)

14、影響菌的呼吸代謝。 方法步驟 （一）發(fā)酵培養(yǎng)1 、通氣量的調(diào)節(jié)要加大通氣量，則需調(diào)大進(jìn)氣閥 F13，反之則調(diào)小進(jìn)氣閥 F13的開度；閥F14要作出相 應(yīng)調(diào)整，以保持罐壓。通氣量的測量：通過流量計(jì)進(jìn)行檢測。青霉素發(fā)酵過程中通氣量一般為 1: 1 1: 0.8VVM。2、發(fā)酵溫度、pH、轉(zhuǎn)速、流加控制、消泡等各參數(shù)的調(diào)整按照“ DF-BIC 控制系統(tǒng)或發(fā)酵罐過程控制系統(tǒng)的操作說明”所述方法進(jìn)行調(diào)整。將控 制器設(shè)置至“開機(jī)”狀態(tài)，并分別按“加熱” 、“冷卻”、“攪拌”鍵，使之置于“自動(dòng)”狀態(tài)。 此時(shí)， 各參數(shù)進(jìn)入自動(dòng)控制， 并根據(jù)記錄周期所定的時(shí)間進(jìn)行各參數(shù)的記錄。 如果在自動(dòng)控 制過程中某參數(shù)出現(xiàn)

15、過調(diào)或調(diào)不到所需值， 則需調(diào)整該參數(shù)設(shè)定值中的 “開度”。如果過調(diào)， 則需減小“開度”值；如果調(diào)不到所需值，則需加大“開度”值。青霉素發(fā)酵溫度設(shè)定在 23C, pH控制在6.46.6，流加氨水溶液控制；消泡自動(dòng)控制；轉(zhuǎn)速待定。3、DO 電極的滿度校正當(dāng)溫度、通風(fēng)量、罐壓、攪拌轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，將此時(shí)的 DO 值校正為 100% 。4、將預(yù)先準(zhǔn)備好的堿液和滅過菌的消泡劑、流加物料及硅膠管與蠕動(dòng)泵及發(fā)酵罐（將 針插入發(fā)酵罐備用口）聯(lián)接好；注意操作過程中必須保持無菌。5、打開“ pH”、“消泡”、“流加”開關(guān)，將手動(dòng)、自動(dòng)開關(guān)置于“自動(dòng)”位置。此時(shí)， 上述參數(shù)進(jìn)入自動(dòng)控制。6、 取樣測定發(fā)酵過程中還原糖含

16、量、青霉素效價(jià)、 酸堿度等指標(biāo)。 取樣步驟按 GUJS-10 說明進(jìn)行。（二）單片機(jī)控制GUJS-10 型攪拌發(fā)酵系統(tǒng)配備了先進(jìn)的自動(dòng)控制系統(tǒng)。 DF-BIC 控制系統(tǒng)可分為以下兩 種控制。1、自動(dòng)控制（1）打開單片機(jī)確定運(yùn)行狀態(tài)為開機(jī)狀態(tài)。（ 2）打開單片機(jī)的主界面，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)定，選定所需要設(shè)定的參數(shù)，最常用的是溫度、 pH 值、 DO 值、攪拌機(jī)速度等。將所設(shè)定數(shù)據(jù)輸入單片機(jī)后，按下回車鍵，單片機(jī)進(jìn)入設(shè) 定狀態(tài)，否則輸入無效。（ 3）返回主界面，將所有的已設(shè)定參數(shù)中能夠使該參數(shù)上升或減少（雙向控制）的功 能鍵均打開，并處于綠色指示燈狀態(tài)。如溫度的設(shè)定：將升溫和降溫同時(shí)打開為綠燈指示， 使之處于自動(dòng)控制狀態(tài)。注意：自動(dòng)控制必須是在雙向控制均存在時(shí)才起作用。2、手動(dòng)控制（1）打開單片機(jī)確定運(yùn)行狀態(tài)為開機(jī)狀態(tài)。（ 2）將雙向控制鍵設(shè)定于紅燈狀態(tài)下，此時(shí)處于手動(dòng)狀態(tài)。（ 3）將雙向控制鍵中能達(dá)到你需要參數(shù)數(shù)據(jù)的