分子生物學(xué) 第三章 DNA的復(fù)制和修復(fù)

1、精選ppt 第三章第三章 DNA的復(fù)制的復(fù)制 DNADNA是由四種脫氧核糖核酸所組成的長是由四種脫氧核糖核酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。 生物體的遺傳信息就貯存在生物體的遺傳信息就貯存在DNADNA的四種的四種脫氧核糖核酸的排列順序中。脫氧核糖核酸的排列順序中。 精選ppt DNA DNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；給子代； 通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。 DNA DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯

2、過程就構(gòu)成了了遺傳學(xué)的中心法則遺傳學(xué)的中心法則。 精選ppt 在在RNARNA病毒中，其遺傳信息貯存在病毒中，其遺傳信息貯存在RNARNA分子中。分子中。 因此，在這些生物體中，遺傳信息的因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是流向是RNARNA通過復(fù)制，將遺傳信息由親代通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給遞給DNADNA，再由，再由DNADNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就豐富給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就豐富了了中心法則的內(nèi)容中心法則的內(nèi)容。精選pptDNA dependent DNA poly

3、meraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDP 復(fù)制（復(fù)制（DDDPDDDP） 轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄（DDRPDDRP） 翻譯翻譯 DNA RNA DNA RNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄（RDDPRDDP） RNA RNA 復(fù)制（復(fù)制（RDRPRDRP） 精選ppt精選ppt 第一節(jié)第一節(jié) DNADNA復(fù)制概況復(fù)制概況 一一. DNA. DNA復(fù)制的半保留性復(fù)制的半保留性 DNA DNA在復(fù)制時(shí)，以親代在復(fù)制時(shí)，以親代DNADNA的每

4、一股的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNADNA，每個(gè)子代，每個(gè)子代DNADNA中都含有一股親代中都含有一股親代DNADNA鏈，這種現(xiàn)象稱為鏈，這種現(xiàn)象稱為DNADNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制(semi-conservative replication)(semi-conservative replication)。 精選ppt DNA DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在19581958年由年由M. M. Meselson Meselson 和和 F. Stahl F. Stahl 所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)所完成的實(shí)驗(yàn)所證明

5、。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含首先將大腸桿菌在含1515N N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其其DNADNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)橹械膲A基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?515N N。將大腸桿菌移至只含。將大腸桿菌移至只含1414N N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNADNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果： 精選ppt二二. . 復(fù)制子（replicon) 復(fù)制子:基因組中能單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制的單位。 每個(gè)起始點(diǎn)到終止點(diǎn)的區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)復(fù)制子。 精選ppt1. 起始點(diǎn)（origin of replication ,

6、ori) 原核生物DNA分子中只有一個(gè)起始點(diǎn)，長度 200bp左右。 大腸桿菌ori C有245 bp。 真核生物有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。精選ppt精選ppt E.coli 中的Ori區(qū)富含AT和回文對稱的序列。 這種特殊的結(jié)構(gòu)與復(fù)制起點(diǎn)易于解鏈以發(fā)動(dòng)DNA復(fù)制（形成“呼吸現(xiàn)象”）和促進(jìn)聚合酶與DNA結(jié)合的功能高度統(tǒng)一。精選ppt isolation of ori精選ppt rich AT & palindromerich AT & palindrome Enzymes binding site Enzymes binding site 300 bp 300 bp in replic

7、ation origin in replication origin 0f Prokaryote 0f ProkaryoteAT rich復(fù)制起點(diǎn)的特征復(fù)制起點(diǎn)的特征精選ppt大腸桿菌大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三個(gè)三個(gè)13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)四個(gè)9bp序列序列DnaADnaB(解螺旋酶解螺旋酶)SSB大腸桿菌大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型精選ppt2. 終點(diǎn)（ter） 對E.coli DNA復(fù)制過程

8、的研究發(fā)現(xiàn)，其兩個(gè)復(fù)制叉總是在一個(gè)固定的位點(diǎn)相遇，這個(gè)特殊的位點(diǎn)包含兩個(gè)分別由3個(gè)終止子（terminus）組成的終止區(qū)域ter E，ter D，ter A和ter F，ter C，ter B，其中每個(gè)終止子含有相對保守的22bp序列（有說23bp共有序列？） ，分別負(fù)責(zé)對不同區(qū)域的復(fù)制叉行使終止功能。精選ppt 目前已經(jīng)分離出相對分子質(zhì)量為3.6103的終止蛋白Tus（terminus utilization substance）。 這種終止蛋白能識(shí)別ter序列，形成terTus復(fù)合體，以防止DNA過度復(fù)制，避免出現(xiàn)DNA多聚體。 精選ppt 為了保證DNA復(fù)制的完整性，每一個(gè)復(fù)制叉必須穿過

9、另一復(fù)制叉的終止區(qū)才能到達(dá)自身終止區(qū)，并可以在其中3個(gè)位點(diǎn)的任一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生終止。 如果兩個(gè)復(fù)制叉的延伸速度不一致，或因某種原因一個(gè)復(fù)制叉的延伸過程被拖延，先期到達(dá)終止子的復(fù)制叉會(huì)停留等待另一復(fù)制叉的經(jīng)過，共同完成全基因組的復(fù)制過程。 精選ppt三. 復(fù)制的方向性 復(fù)制的方向：單向或雙向 精選ppt 復(fù)制的多模式復(fù)制的多模式 單起點(diǎn)、單方向單起點(diǎn)、單方向多起點(diǎn)、單方向多起點(diǎn)、單方向單起點(diǎn)、雙方向單起點(diǎn)、雙方向多起點(diǎn)、雙方向多起點(diǎn)、雙方向精選ppt Direction of DNA replication單向復(fù)制雙向復(fù)制精選ppt雙向復(fù)制雙向復(fù)制 DNADNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向復(fù)制時(shí)，

10、以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。 精選ppt精選ppt精選ppt精選ppt四四. . 引物引物RNARNA DNA復(fù)制的起始必須先期合成一段引復(fù)制的起始必須先期合成一段引物分子。物分子。 研究表明無論是原核生物還是真核生研究表明無論是原核生物還是真核生物，大多數(shù)引物復(fù)制是一段長度不等的，物，大多數(shù)引物復(fù)制是一段長度不等的，一般為一般為10個(gè)核苷酸左右的個(gè)核苷酸左右的RNA分子分子。（有。（有說說為為1 11010個(gè)核苷酸？）個(gè)核苷酸？） 精選ppt 所有DNA聚合酶具有一個(gè)

11、共同的特點(diǎn)均不能自主地發(fā)動(dòng)DNA的復(fù)制，只能利用已提供的核苷酸3OH末端聚合dNMP，合成DNA鏈。 它們必須以一段具有它們必須以一段具有33端自由羥基（端自由羥基（3-3-OHOH）的）的RNARNA作為引物作為引物(primer) (primer) ，才能開始聚合，才能開始聚合子代子代DNADNA鏈。鏈。 引物引物RNARNA的堿基順序，與其模板的堿基順序，與其模板DNADNA的堿基的堿基順序相配對。順序相配對。精選ppt五五. DNA. DNA的半不連續(xù)復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制 由于由于DNADNA聚合酶只能以聚合酶只能以5353方向聚合方向聚合子代子代DNADNA鏈鏈，即，即模板模板DNAD

12、NA鏈鏈的的方向必須為方向必須為3535。 因此，分別以兩條親代因此，分別以兩條親代DNADNA鏈作鏈作為模板聚合子代為模板聚合子代DNADNA鏈時(shí)的方式是不鏈時(shí)的方式是不同的。同的。精選ppt 以以3535方向的親方向的親代代DNADNA鏈作模板的子代鏈鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)橄驗(yàn)?353，這一條鏈，這一條鏈被稱為被稱為前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading (leading strand)strand)。 而以而以5353方向的方向的親代親代DNADNA鏈為模板的子代鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，鏈在復(fù)制時(shí)則

13、是不連續(xù)的，其 鏈 的 聚 合 方 向 也 是其 鏈 的 聚 合 方 向 也 是5353，這條鏈被稱為，這條鏈被稱為滯后鏈滯后鏈(lagging strand)(lagging strand)。精選ppt 由于親代由于親代DNADNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，滯后鏈的合成也是一段一開的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的。段的。DNADNA在復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的在復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的一些子代一些子代DNADNA短鏈稱為短鏈稱為岡崎片段岡崎片段(Okazaki (Okazaki fragment)fragment)。 岡崎片段的大小，在原核生物中約岡崎片段的大小，

14、在原核生物中約為為1000100020002000個(gè)核苷酸，而在真核生物個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為中約為100100個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。 精選ppt 第二節(jié)參與第二節(jié)參與DNADNA復(fù)制的酶、相復(fù)制的酶、相關(guān)蛋白及酶學(xué)機(jī)制關(guān)蛋白及酶學(xué)機(jī)制 在細(xì)胞中，雙螺旋在細(xì)胞中，雙螺旋DNADNA復(fù)制是復(fù)制是DNADNA聚聚合酶催化的酶促反應(yīng)過程。合酶催化的酶促反應(yīng)過程。但但DNADNA聚合酶只能延長已有的聚合酶只能延長已有的DNADNA或或RNARNA引物鏈，不能從頭起始引物鏈，不能從頭起始DNADNA鏈的合鏈的合成成精選ppt另外，在另外，在DNADNA復(fù)制中形成特殊的復(fù)制復(fù)制中形成特殊的復(fù)制叉（或生

15、長叉）結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，叉（或生長叉）結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，DNADNA雙螺旋中雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起，要拷貝每一條鏈的兩條鏈纏繞在一起，要拷貝每一條鏈都必須將雙螺旋都必須將雙螺旋DNADNA解旋（解旋（unwindingunwinding），），并釋放或吸收由此產(chǎn)生的扭力，這就要并釋放或吸收由此產(chǎn)生的扭力，這就要求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成DNADNA聚合酶不能完成這一過程聚合酶不能完成這一過程精選ppt在不連續(xù)合成中形成短的岡崎在不連續(xù)合成中形成短的岡崎片段（片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment）的連接）的連接也是也是DNADNA聚合酶

16、無法完成的。聚合酶無法完成的。實(shí)際上，在復(fù)制叉處進(jìn)行復(fù)雜實(shí)際上，在復(fù)制叉處進(jìn)行復(fù)雜的的DNADNA復(fù)制過程中，需要許多相關(guān)的復(fù)制過程中，需要許多相關(guān)的酶和蛋白因子參與。酶和蛋白因子參與。精選ppt除除DNADNA聚合酶外，還包括：聚合酶外，還包括： DNADNA旋轉(zhuǎn)酶旋轉(zhuǎn)酶； 使使DNADNA雙股鏈在復(fù)制叉解開的雙股鏈在復(fù)制叉解開的解旋酶解旋酶； 在在DNADNA復(fù)制前防止解開的復(fù)制前防止解開的DNADNA單鏈局部退火的單鏈局部退火的DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白； 合成合成RNARNA引物的酶引物的酶； 除去除去RNARNA引物的酶；引物的酶； 使岡崎片段共價(jià)連接的使岡崎片段共價(jià)連接的DNAD

17、NA連接酶連接酶等重要的酶等重要的酶與蛋白因子。與蛋白因子。精選ppt DNA聚合酶、引物的引發(fā)酶、DNA解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、連接酶等在內(nèi)的如此眾多的酶分子均集中在復(fù)制交叉處組成一個(gè)復(fù)合體協(xié)同互作，共同完成DNA分子的復(fù)制過程，這種復(fù)合體也稱為DNA復(fù)制體（replisome） 。精選ppt一. DNA聚合酶（一）（一）原核生物原核生物DNADNA聚合酶聚合酶種類種類 在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNADNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase,DNA pol)有五種有五種: : DNADNA聚合酶聚合酶（ DNADNA pol pol ）、）、 DNA DNA聚合

18、酶聚合酶（ DNADNA polpol）、）、 DNA DNA聚合酶聚合酶（ DNADNA polpol）、）、 DNA DNA聚合酶聚合酶（ DNADNA pol pol ）、）、 DNA DNA聚合酶聚合酶（ DNADNA polpol） 精選ppt 前三種酶（前三種酶（DNADNA聚合酶聚合酶、DNADNA聚合酶聚合酶、 DNADNA聚合酶聚合酶都屬于具有多種酶活性的多功能都屬于具有多種酶活性的多功能酶。酶。 DNADNA聚合酶聚合酶催化催化DNA新鏈中脫氧核苷酸之新鏈中脫氧核苷酸之間的聚合反應(yīng)的酶。間的聚合反應(yīng)的酶。 參與參與DNADNA復(fù)制的主要是復(fù)制的主要是polpol和和polp

19、ol。 精選ppt. DNA聚合酶I 1958年Kornberg首先從大腸桿菌提取DNA聚合酶I 。 大腸桿菌K-12株的DNA聚合酶I由基因polA編碼，由928個(gè)氨基酸組成，分子量103.1kDa，結(jié)構(gòu)類似球狀，直徑約650nm，每個(gè)細(xì)胞約有400個(gè)分子。 精選ppt 此酶的模板專一性和底物專一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為底物。精選ppt 1）聚合作用：5 3； 2）3 5外切酶活性：校對（或正）功能； 3）5 3外切酶活性：引物切除、損傷修復(fù)，主要功能是切除引物、填補(bǔ)岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復(fù)；精選ppt精選ppt精選ppt 如果新鏈合成過程中出

20、現(xiàn)錯(cuò)配，新添加的核苷酸因?yàn)榕c模板不能正確配對，將形成單鏈尾巴，此單鏈末端可被DNA聚合酶識(shí)別，并以3-5外切酶活性切除此核苷酸，再用其聚合酶活性配對正確的核苷酸，此功能被稱為校讀功能。精選ppt DNA pol是單一肽鏈的大分子,分子量為109kD,二級結(jié)構(gòu)以-螺旋為主。 用特異的蛋白酶（如枯草桿菌蛋白酶）處理，可把DNA pol水解為兩個(gè)片段，即在F，G螺旋之間發(fā)生斷裂。 精選ppt 小片段，具有323個(gè)氨基酸殘基，小片段的分子量為35KD，具有 5 3外切酶活性。 可以逐個(gè)切除處于配對狀態(tài)的具5磷酸末端的核苷酸，一次最多可以切除10個(gè)核苷酸。 精選ppt 大片段或稱Klenow片段，具有6

21、04個(gè)氨基酸殘基，分子量為68KD， 具有DNA聚合酶活性和3 5外切酶活性； 53聚合酶活性使Klenow片段可以3OH末端添加新的核苷酸延長已存在的多核苷酸鏈。 精選ppt 3-5外切酶活性則令Klenow片段可以從DNA的3端，即新鏈生長端開始逐個(gè)切除核苷酸。 此活性傾向于切除DNA合成中的末端錯(cuò)配堿基。精選ppt 以上三重活性相結(jié)合，使DNA聚合酶I適用于取出起始DNA合成所需的RNA引物，并填充去除引物后DNA雙鏈中出現(xiàn)的短單鏈區(qū)域。 精選ppt 類似的短單鏈區(qū)域也可出現(xiàn)在DNA損傷修復(fù)過程中切除錯(cuò)誤堿基后，故DNA聚合酶I也可用于損傷DNA的修復(fù)。 但DNA聚合酶I的延伸能力不強(qiáng)，

22、與模板接合一次只能使核苷酸鏈延長20-100個(gè)核苷酸，在新鏈的延長反應(yīng)中不可能起主要作用。精選ppt pol pol為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì)為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì), ,可被特可被特異的蛋白酶水解為兩個(gè)片段，其中的大片段稱異的蛋白酶水解為兩個(gè)片段，其中的大片段稱為為Klenow fragmentKlenow fragment，具有，具有5353聚合酶聚合酶活性活性和和3535外切酶外切酶的活性。的活性。 精選ppt精選ppt精選ppt2. DNA聚合酶I I DNA聚合酶I I具有 5 3聚合酶活性及3 5外切核酸酶活性。精選ppt3. DNA聚合酶I I I 該酶由10 個(gè)亞基組成，分別為、

23、及。 DNA聚合酶具很強(qiáng)的延伸能力，能在新鏈上每分鐘添加105個(gè)核苷酸。 它是原核生物體內(nèi)真正起復(fù)制作用的酶。精選ppt亞基： 5 3聚合酶活性；亞基：3 5外切酶,校對和編輯；為裝配必須； 以上三者構(gòu)成核心酶。精選pptDNA聚合酶為不對稱異源二聚體 每個(gè)DNA聚合酶含有二個(gè)拷貝的核心酶，另外有二個(gè)拷貝的二聚化亞基 連接這二個(gè)核心酶； 二個(gè)拷貝的 亞基負(fù)責(zé)保持核心酶與模板鏈的結(jié)合并使酶能夠沿模板鏈移動(dòng)； 另外五種亞基組成復(fù)合體，可促進(jìn)全酶組裝并使 亞基結(jié)合到DNA上。精選ppt大腸桿菌DNA聚合酶精選ppt pol pol 由十種亞基組成，其中由十種亞基組成，其中亞亞基具有基具有5353聚合

24、聚合DNADNA的酶活性，因而的酶活性，因而具有復(fù)制具有復(fù)制DNADNA的功能；而的功能；而亞基具有亞基具有3535外切酶的活性，因而與外切酶的活性，因而與DNADNA復(fù)制復(fù)制的校正功能有關(guān)。的校正功能有關(guān)。 精選ppt大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶全酶的結(jié)構(gòu)和功能全酶的結(jié)構(gòu)和功能 延長因子延長因子DNADNA聚合酶聚合酶 兩個(gè)兩個(gè) 亞基夾住亞基夾住DNADNADNADNA聚合酶聚合酶異二聚體異二聚體核心酶核心酶校對校對引物的結(jié)引物的結(jié)合和識(shí)別合和識(shí)別促使核心促使核心酶二聚化酶二聚化精選ppt前導(dǎo)鏈與后隨鏈復(fù)制的方向不同 位于前導(dǎo)鏈DNA延伸點(diǎn)的復(fù)制體在完成一個(gè)岡崎片段的復(fù)制后必須解體，或

25、以復(fù)制體整體方式才岡崎片段的末端解離后又迅速“調(diào)轉(zhuǎn)車頭”結(jié)合到新的起點(diǎn)合成岡崎片段。 在大腸桿菌中完成一次基因組復(fù)制，復(fù)制體需要啟動(dòng)20004000次的岡崎片段的復(fù)制。精選ppt 顯然這種模式是不符合生物進(jìn)化的“經(jīng)濟(jì)原則”的。 隨后的研究證明每一個(gè)復(fù)制叉均含有一個(gè)DNA聚合酶的二聚體，它可以同時(shí)催化前導(dǎo)鏈和后隨鏈的同時(shí)復(fù)制?；谶@一科學(xué)發(fā)現(xiàn)，人們提出了在雙鏈DNA復(fù)制進(jìn)程中“回環(huán)模型”。精選ppt回環(huán)模型 即在復(fù)制叉處僅有一個(gè)大型的DNA復(fù)制體，后隨鏈的一個(gè)岡崎片段模板DNA以倒退的方式從DNA聚合酶中將模板DNA釋放出來，新岡崎片段的DNA單鏈與前導(dǎo)鏈一樣，以相同的方向完成復(fù)制。 以滾環(huán)模式

26、擴(kuò)增DNA的生物在復(fù)制叉處也是按回環(huán)模型完成DNA復(fù)制的。精選ppt精選ppt聚合酶聚合酶III核心酶核心酶大腸桿菌復(fù)制大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶聚合酶I聚合酶聚合酶III核心酶核心酶滯后鏈滯后鏈前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈解螺旋酶解螺旋酶引物合成酶引物合成酶RNA引物引物引發(fā)體引發(fā)體拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶II -夾子夾子 -聚體聚體 -夾子夾子 -復(fù)合物復(fù)合物RNA引物引物單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白（SSB）精選ppt復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物聚合酶聚合酶III全酶全酶引物引物引物體引物體引物體引物體解旋酶解

27、旋酶解旋酶解旋酶精選ppt精選ppt性質(zhì) 聚合酶聚合酶聚合酶3 5 外切活性+ + + +5 3 外切活性+-5 3 聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生鏈合成-+主要是對主要是對DNADNA損傷的修損傷的修復(fù)；以及在復(fù)；以及在DNADNA復(fù)制時(shí)復(fù)制時(shí)切除切除RNARNA引物并填補(bǔ)其引物并填補(bǔ)其留下的空隙。留下的空隙。修復(fù)紫外修復(fù)紫外光引起的光引起的DNADNA損傷損傷DNA DNA 復(fù)制的主要復(fù)制的主要聚合酶，還具有聚合酶，還具有3 3-5-5 外切酶的外切酶的校對功能，提高校對功能，提高DNADNA復(fù)制的保真性復(fù)制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）精選pptDNADNA聚合酶的聚合

28、酶的3 - 5 外切酶水解位點(diǎn)外切酶水解位點(diǎn)3 3 5 5 錯(cuò)配堿基錯(cuò)配堿基3 - 5 核酸外切核酸外切酶水解位點(diǎn)酶水解位點(diǎn)精選pptDNA聚合酶聚合酶5 - 3 外切酶活力外切酶活力5 - 3 核酸外切核酸外切酶水解位點(diǎn)酶水解位點(diǎn)單鏈缺口單鏈缺口5 精選ppt DNA聚合酶和是在1999年才被發(fā)現(xiàn)的，它涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)(errorprone repair)。 當(dāng)DNA受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，使修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性（accuracy)，因而出現(xiàn)高突變率。 高突變率雖會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細(xì)胞得以存活。精選ppt（二）真核生物中的（二）真核生物中的

29、DNADNA聚合酶聚合酶 在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNADNA聚合聚合酶有五種，分別命名為酶有五種，分別命名為DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol）。）。精選ppt 其中，參與染色體其中，參與染色體DNADNA復(fù)制的是復(fù)制的是polpol（延長滯后鏈）和（延長滯后鏈）和polpol（延長前（延長前導(dǎo)鏈），導(dǎo)鏈）， 參與線粒體參與線粒體DNADNA復(fù)制的是復(fù)制的是polpol， p

30、olpol與與DNADNA損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，缺口有關(guān)， polpol只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作用。揮作用。 精選ppt其他學(xué)者的意見：真核生物DNA聚合酶、及四種，都有5 3聚合功能。及參與核DNA復(fù)制； ：鏈合成的引發(fā)，：鏈的延長 pol；切除引物后填補(bǔ)空隙 ：外切核酸酶 ：線粒體DNA復(fù)制精選ppt 定位 細(xì)胞核 細(xì)胞核 線粒體 細(xì)胞核 細(xì)胞核3-5外切 - - + + +酶活性功能引物引物 合成合成修復(fù)修復(fù)作用作用線粒體線粒體DNADNA的復(fù)制的復(fù)制核核DNADNA的復(fù)制的復(fù)制？真核生物中的DNA聚合酶精選ppt 至今為止，所

31、有已發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶都不能從頭合成多核苷酸鏈，而只能通過從3OH末端添加新的核苷酸延長已存在的多核苷酸鏈。 此特性決定了復(fù)制中新鏈的合成方向。 精選ppt（三）（三）DNADNA復(fù)制的保真性（即忠實(shí)性）復(fù)制的保真性（即忠實(shí)性） 為了保證遺傳的穩(wěn)定，為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNADNA的復(fù)制必的復(fù)制必須具有高保真性。須具有高保真性。DNADNA復(fù)制時(shí)的保真性主復(fù)制時(shí)的保真性主要與下列因素有關(guān)：要與下列因素有關(guān)： 1 1遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律； 2 2DNADNA聚合酶在復(fù)制時(shí)對堿基的正確選擇；聚合酶在復(fù)制時(shí)對堿基的正確選擇； 3 3對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校對復(fù)制過程

32、中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校正。正。合成時(shí)以RNA為引物精選pptDNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能5 5 - -核酸核酸外切酶外切酶3 3 - -核酸核酸外切酶外切酶裂縫裂縫聚合中心聚合中心裂縫內(nèi)部裂縫內(nèi)部精選pptDNA聚合酶的校對功能聚合酶的校對功能聚合酶聚合酶錯(cuò)配鹼基錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向復(fù)制方向正正 確核確核苷酸苷酸5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 切除錯(cuò)配切除錯(cuò)配核苷酸核苷酸精選pptDNA復(fù)制為什么要合成一個(gè)復(fù)制為什么要合成一個(gè)RNA引物，而引物，而后又把這個(gè)引物消除呢？后又把這個(gè)引物消除呢？ 這是保證這是保證DNA聚合過程高度精確的又一措施。聚合過程高度精確的又一措施。

33、已知已知DNA 聚合酶具有聚合酶具有35 外切酶功能校對復(fù)制外切酶功能校對復(fù)制過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個(gè)新過程中的核苷酸，也就是說聚合酶在開始形成一個(gè)新的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個(gè)堿基是否正確，這的磷酸二酯鍵前，總是檢查前一個(gè)堿基是否正確，這就決定了它不能從頭開始合成。就決定了它不能從頭開始合成。 因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來開始因此先合成一條低忠實(shí)性的多核苷酸來開始DNA的合成，并以核糖核苷酸來表示是的合成，并以核糖核苷酸來表示是“暫時(shí)暫時(shí)”的，當(dāng)?shù)模?dāng)DNA開始聚合以后再以開始聚合以后再以53 外切酶的功能切除，以高外切酶的功能切除，以高忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之

34、，確保復(fù)制的忠實(shí)性。忠實(shí)性的脫氧核苷酸取而代之，確保復(fù)制的忠實(shí)性。精選ppt二二. .DNADNA旋轉(zhuǎn)酶與旋轉(zhuǎn)酶與DNADNA超螺旋的超螺旋的松馳松馳天然DNA的負(fù)超螺旋雖然有利于DNA的解旋，但隨著復(fù)制的進(jìn)行，復(fù)制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力，因此復(fù)制中需要DNA旋轉(zhuǎn)酶去除解螺旋酶的解鏈產(chǎn)生的扭曲張力。精選ppt大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）又稱拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase ），由四個(gè)亞基組成四聚體22真核的呈二聚體。DNA旋轉(zhuǎn)酶的作用機(jī)制如圖5-6所示。精選ppt圖5-6 DNA旋轉(zhuǎn)酶引入超螺旋的分子模型：DNA雙鏈以右手方向繞在四聚體的酶上； ：DNA雙鏈被切斷

35、，兩個(gè)亞基以其連接處為鉸鏈轉(zhuǎn)動(dòng)，張開其靠近DNA斷裂點(diǎn)的部分； ：未斷的DNA雙鏈 穿過切口； ：連接斷裂的DNA，以左手方向繞在酶分子上； ：連接好的DNA釋放出來。精選ppt ：DNA雙鏈以右手方向繞在四聚體的酶上； ：DNA雙鏈被切斷，兩個(gè)亞基以其連接處為鉸鏈轉(zhuǎn)動(dòng)，張開其靠近DNA斷裂點(diǎn)的部分； ：未斷的DNA雙鏈穿過切口； ：連接斷裂的DNA，以左手方向繞在酶分子上； ：連接好的DNA釋放出來。精選pptDNA旋轉(zhuǎn)酶每作用一次產(chǎn)生兩個(gè)負(fù)超螺旋，因此可以消除復(fù)制叉向前移動(dòng)所產(chǎn)生的正超螺旋，并且復(fù)制完的兩個(gè)子代DNA雙鏈的分離也需要DNA旋轉(zhuǎn)酶的催化功能。當(dāng)加入DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉

36、素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixic acid）等時(shí)均能抑制細(xì)菌DNA的合成?？梢奃NA旋轉(zhuǎn)酶是DNA復(fù)制所必不可少的。精選ppt拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase) 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶可使可使DNA雙鏈中的一條雙鏈中的一條鏈切斷，松開雙螺鏈切斷，松開雙螺旋后再將旋后再將DNA鏈連鏈連接起來，從而避免接起來，從而避免出現(xiàn)鏈的纏繞。出現(xiàn)鏈的纏繞。拓拓?fù)洚悩?gòu)酶撲異構(gòu)酶可切斷可切斷DNA雙鏈，使雙鏈，使DNA的超螺旋松解后，的超螺旋松解后，再將其連接起來。再將其連接起來。大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)精選ppt

37、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA Topisomerase)： 拓?fù)洚悩?gòu)酶：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。例：大腸桿菌中的蛋白 拓?fù)洚悩?gòu)酶：該酶能暫時(shí)性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。 例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶精選pptDNA旋轉(zhuǎn)酶對真核細(xì)胞有絲分裂也是非常重要，如果不解開纏繞，在任何細(xì)胞周期中姐妹染色體都將無法分離。此外，DNA旋轉(zhuǎn)酶在轉(zhuǎn)錄、同源重組及可移動(dòng)元件的轉(zhuǎn)座中都起重要作用。 精選ppt三三. .DNADNA解旋酶解旋酶復(fù)制過程中，復(fù)制叉在不斷前進(jìn)，復(fù)制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈，為使復(fù)

38、制能夠順利進(jìn)行，就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內(nèi)局部“退火”并保證其完整性與伸展性，使單鏈DNA處于穩(wěn)定的狀態(tài)。承擔(dān)上述任務(wù)是DNA解旋酶（DNA helicase）和單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-strand binding protein, SSB）。精選ppt DNA解旋酶是很多細(xì)胞過程所要求的（如核苷酸切除修復(fù)、同源重組、轉(zhuǎn)錄終止）。DNA解旋酶是利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動(dòng)的一類酶的總稱（又稱解鏈酶）。原核生物大腸桿菌為DnaB和Rep蛋白，DnaB結(jié)合于滯后鏈模板沿53方向前進(jìn)，Rep蛋白結(jié)合于前導(dǎo)鏈模板沿35方向移動(dòng)（圖5-

39、7）。精選ppt8、DNA 解螺旋酶 /解鏈酶（DNA helicase) 通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。reprep蛋白沿蛋白沿3 3 5 5移動(dòng)，而解螺旋酶移動(dòng)，而解螺旋酶I I、IIII、IIIIII沿沿5 5 3 3移動(dòng)。移動(dòng)。精選pptDNA解鏈酶解鏈酶 解鏈酶或解鏈酶或rep蛋白，是蛋白，是用于解開用于解開DNA雙鏈的雙鏈的酶蛋白，每解開一對酶蛋白，每解開一對堿基，需消耗兩分子堿基，需消耗兩分子ATP。目前發(fā)現(xiàn)存在。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在兩種解鏈酶。至少存在兩種解鏈酶。 精選ppt真核生物病毒中大T-抗

40、原（T-antigen, T-ag）具解開雙鏈的功能。此外也在一些真核生物中分離純化出多種DNA解旋酶，其功能還在鑒定證實(shí)中。精選ppt 圖5-7 DNA雙螺旋的解旋精選ppt四. 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB），又稱螺旋反穩(wěn)又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（蛋白（HDPHDP）。這是一些能夠與單鏈）。這是一些能夠與單鏈DNADNA結(jié)合的結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。蛋白質(zhì)因子。在細(xì)胞內(nèi)行使很多涉及單鏈區(qū)域穩(wěn)定性的功能（如同源重組）。其作用為：其作用為： 使解開雙螺旋后的使解開雙螺旋后的DNADNA單鏈單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNADNA，便于以其為，便于以其為模板復(fù)制子

41、代模板復(fù)制子代DNADNA； 保護(hù)單鏈保護(hù)單鏈DNADNA，避免核，避免核酸酶的降解。酸酶的降解。精選ppt在復(fù)制中，這包括穩(wěn)定熔解起點(diǎn)，維持解旋酶活性，從DNA模板上去除二級結(jié)構(gòu)以及抑制核酸酶活性。即SSB與DNA單鏈相結(jié)合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈，從而保持一種伸展?fàn)顟B(tài)，以保證復(fù)制順利進(jìn)行。在E.coli中SSB為四聚體，對單鏈DNA有很高的親和性，但對雙鏈DNA和RNA沒有親合力。精選ppt它們與DNA結(jié)合時(shí)有協(xié)同作用，即有一個(gè)SSB與DNA結(jié)合時(shí)，就會(huì)有更多的SSB迅速結(jié)合上去擴(kuò)展分布整個(gè)DNA單鏈，將DNA包被上蛋白聚合體。SSB有某些堿基組成的

42、傾向性，但很少有順序?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，可以周而復(fù)始地循環(huán)使用，在DNA的修復(fù)和重組中都有SSB的參與。 精選ppt單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白單鏈單鏈DNADNA結(jié)合蛋白（結(jié)合蛋白（single strand binding single strand binding protein, SSBprotein, SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDPHDP）。）。這是一些能夠與單鏈這是一些能夠與單鏈DNADNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：其作用為： 使解開雙螺旋后的使解開雙螺旋后的DNADNA單鏈能夠單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNADNA，

43、便于以其為模板，便于以其為模板復(fù)制子代復(fù)制子代DNADNA； 保護(hù)單鏈保護(hù)單鏈DNADNA，避免核酸酶，避免核酸酶的降解。的降解。 精選ppt五.引發(fā)酶與引物RNA的合成 已經(jīng)證明，DNA的半不連續(xù)復(fù)制中，DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今為止，人們所發(fā)現(xiàn)的引物大多為一段RNA，其長度和序列隨著基因組的種類而表現(xiàn)出不同，在大多數(shù)情況下為110個(gè)核苷酸（表5-3）。精選ppt基因組引物長度主要的引物序列*T7T4174大腸桿菌海膽果蠅多瘤病毒動(dòng)物151515大約1018大約9大約10大約9pppApCpC/ApN12 (N主要為A和C)pppApCpN3

44、pppAp N04pppAC (N) 710(p) ppA/Gp N7pppA (N) 79pppA/Gp N9末測定 表5-3 DNA復(fù)制中滯后鏈前體片斷的RNA引物精選ppt DNA復(fù)制中以RNA作引物的實(shí)驗(yàn)證據(jù)是噬菌體M13的DNA復(fù)制對轉(zhuǎn)錄抑制劑的敏感性實(shí)驗(yàn)提供的，其結(jié)果指出RNA可能提供了DNA復(fù)制的3端。此外，Reiji等設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)也證明RNA引物是DNA復(fù)制必須的精選pptReiji等設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)即利用含甲苯的緩沖液處理大腸桿菌以提高該菌對外源核苷酸的通透性，然后再以大腸桿菌與-32P脫氧核苷三磷酸（dNTP）和未標(biāo)記的核糖核苷三磷酸（NTP）的混合物保溫，最后從大腸桿菌分離DNA

45、和用稀堿處理。堿性水解發(fā)生在3,5-磷酸二酯鍵的磷酸基與C-5間，這樣就使dNTP的放射性磷轉(zhuǎn)移到核糖核苷酸上去（圖5-8）。精選ppt結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每一岡崎片段都產(chǎn)生一個(gè)RNA-DNA接頭，說明DNA的復(fù)制是以RNA為引物。 圖5-8 RNA引物存在的實(shí)驗(yàn)證明 精選ppt 催化RNA引物（RNA primer）合成的酶叫引發(fā)酶（primerase）。引發(fā)酶識(shí)別DNA單鏈模板特異順序，以核糖核苷三磷酸為底物合成寡聚核苷酸產(chǎn)生3-OH，為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。 合成岡崎片段引物分子的RNA聚合酶與負(fù)責(zé)RNA轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶是完全不同的兩種酶類。精選ppt 引物與典型的RNA（如m

46、RNA）不同，它們在合成以后并不與模板分離，而是以氫鍵與模板結(jié)合。在轉(zhuǎn)錄的過程中，RNA分子是RNA聚合酶作用下的產(chǎn)物，合成出的RNA分子會(huì)與模板DNA鏈分離。 在E.coli中合成岡崎片段引物分子的RNA聚合酶由dnaG基因編碼，這種RNA聚合酶也稱為引發(fā)酶（primase）。精選pptE.coli的引發(fā)酶是一條肽鏈，分子量為60 000，每個(gè)細(xì)胞中有50100個(gè)分子。該酶單獨(dú)存在時(shí)是相當(dāng)不活潑的，只有在與有關(guān)蛋白質(zhì)相互結(jié)合成為一個(gè)復(fù)合體時(shí)才有活 性 。 這 種 復(fù) 合 體 就 稱 為 引 發(fā) 體（primasome）。 引物分子為DNA聚合酶合成DNA分子提供了啟動(dòng)聚合的3OH末端。精選p

47、pt機(jī)體選擇RNA作為引物，其原因可能在于減少致死突變（lethal mutation）。DNA復(fù)制中，從模板拷貝最初的幾個(gè)核苷酸時(shí)，由于堿基堆集力很弱，其氫鍵結(jié)合能力也很弱，因而堿基對的錯(cuò)配幾率就大很多，加上這幾個(gè)核苷酸還沒有與模板形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA聚合酶35校對功能很難發(fā)揮作用。精選ppt因此為了保證生物DNA復(fù)制的保真度，采用以RNA為引物這種過渡形式，既為DNA聚合酶提供3-羥基端，又容易被 DNA聚合酶識(shí)別而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶進(jìn)行切口平移。切口平移過程中發(fā)生錯(cuò)誤的幾率極少，因?yàn)镈NA聚合酶（pol I）有35外切核酸酶活性，具有校對功能。精選ppt 無論是前導(dǎo)

48、鏈還是后隨鏈的引物均為RNA分子，當(dāng)DNA復(fù)制完成后，必須將RNA引物分子降解。 研究證明，相對分子質(zhì)量為103103的DNA聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后，C端形成相對分子質(zhì)量為68103的大片段，N端形成相對分子質(zhì)量為35103的小片段，大片段具有從5向3方向的聚合DNA功能和從3向5的外切校正功能，但效率較低，也稱klenow片段。小片段具有從5向3方向的外切核酸酶功能。精選ppt六六. .DNADNA連接酶連接酶 DNADNA連接酶連接酶(DNA ligase ) (DNA ligase ) ，1967年發(fā)現(xiàn)若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，連接酶可催化這兩

49、端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。但它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來在在DNADNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用重要作用精選ppt DNADNA連接酶催化的連接酶催化的條條件件是：是： 需一段需一段DNADNA片段具有片段具有3-OH3-OH，而，而另一段另一段DNADNA片段具有片段具有5-Pi5-Pi基；基； 未封閉未封閉的缺口位于雙鏈的缺口位于雙鏈DNADNA中，即其中有一條鏈中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；是完整的?需要需要消耗能量，在原核生消耗能量，在原核生物中由物中由NADNAD+ +供能，在供能，在真核生物中由真核生物中由ATPATP供供能

50、。能。精選pptDNA連連接接酶酶連連接接切切口口Mg2+連接酶連接酶ATP或或NADAMP+PPi或或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口33555533模板鏈模板鏈模板鏈模板鏈精選ppt 第三節(jié)第三節(jié)DNA復(fù)制過程的總結(jié)及其調(diào)控復(fù)制過程的總結(jié)及其調(diào)控 DNA復(fù)制通常是從雙螺旋的特定位置復(fù)制原點(diǎn)（ori）開始，一般是富含A-T的區(qū)段該區(qū)段的雙鏈DNA具有較強(qiáng)的呼吸作用（breathing），是經(jīng)常瞬間處于打開形成單鏈的區(qū)段（frequently opening region）精選ppt “呼吸呼吸現(xiàn)

51、象現(xiàn)象” DNA復(fù)制原點(diǎn)處氫鍵迅速斷裂與再生，復(fù)制原點(diǎn)處氫鍵迅速斷裂與再生， 導(dǎo)致兩條導(dǎo)致兩條DNA鏈不斷解鏈與聚合，鏈不斷解鏈與聚合， 形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程。形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程。 在富含在富含AT的區(qū)域內(nèi)尤為明顯的區(qū)域內(nèi)尤為明顯精選ppt由此產(chǎn)生的瞬時(shí)單鏈與SSB蛋白（single-stranded DNA binding protein，SSB）結(jié)合，對復(fù)制的起始十分重要。原核生物的復(fù)制原點(diǎn)通常為一個(gè)，而真核生物則有多個(gè)特定的復(fù)制原點(diǎn)。精選ppt依DNA合成的起始方式，復(fù)制可分為從新起始與共價(jià)延伸兩種類型前者是前導(dǎo)鏈從新開始，也叫復(fù)制叉式復(fù)制；后者是先導(dǎo)鏈共價(jià)結(jié)合在一條親代鏈

52、上，也叫滾環(huán)式復(fù)制。精選ppt復(fù)制主要以雙向等速進(jìn)行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的復(fù)制；部分是單方向進(jìn)行，如質(zhì)粒ColE1的復(fù)制；或以不對稱的雙向方式進(jìn)行，如線粒體DNA的復(fù)制。精選ppt一一. . 復(fù)制的起始復(fù)制的起始 DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。 1.預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā) （ 1）解旋解鏈，形成復(fù)制叉）解旋解鏈，形成復(fù)制叉由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈成兩條單鏈DNA。精選ppt 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白（結(jié)合蛋白（

53、SSB）結(jié)合在）結(jié)合在兩條單鏈兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。上，形成復(fù)制叉。 DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉復(fù)制叉。 對于雙向復(fù)制而言，形成的對于雙向復(fù)制而言，形成的兩個(gè)復(fù)兩個(gè)復(fù)制叉向相反方向行進(jìn)，制叉向相反方向行進(jìn)，每個(gè)復(fù)制叉上的每個(gè)復(fù)制叉上的兩條兩條DNA鏈均被拷貝。鏈均被拷貝。精選ppt圖5-12 復(fù)制叉 （箭頭表示子鏈總的生長方向） 精選ppt（2 2）引發(fā)體組裝：）引發(fā)體組裝： 由蛋白因子（如由蛋白因子（如dnaBdnaB等）識(shí)別復(fù)制等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶起始點(diǎn)，并與其他蛋白

54、因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。一起組裝形成引發(fā)體。 2.2.引發(fā)引發(fā)在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNADNA為模板，為模板，合成一段短的合成一段短的RNARNA片段，從而獲得片段，從而獲得33端自端自由羥基（由羥基（3-OH3-OH）。）。 精選ppt DNA半不連續(xù)復(fù)制的模式說明，雙鏈DNA分子復(fù)制起始時(shí)從復(fù)制原點(diǎn)處DNA分子解鏈，前導(dǎo)鏈在一段RNA引物的發(fā)動(dòng)下連續(xù)合成的模式完成合成過程，而后隨鏈?zhǔn)前床贿B續(xù)合成的模式不斷地完成岡崎片段的合成，而每個(gè)岡崎片段都需要有RNA引物的發(fā)動(dòng)過程。 精選ppt RNA聚合酶抑制劑利福平對DNA復(fù)制的起始也具有明顯抑制效應(yīng)。但一旦復(fù)制的起始

55、過程完成后，利福平的抑制效應(yīng)也隨之消失，表明前導(dǎo)鏈的RNA引物是由RNA聚合酶合成的。 如同基因轉(zhuǎn)錄過程一樣，此RNA聚合酶可以使雙鏈DNA分子局部開鏈。精選ppt RNA聚合酶在合成1012個(gè)核苷酸RNA片段之后，再由DNA聚合酶完成前導(dǎo)鏈DNA合成； 在完成10002000個(gè)核苷酸的DNA合成后，后隨鏈才在引發(fā)酶的作用下開始岡崎片段的引物RNA的合成。 這一過程也稱為DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活。精選ppt二二復(fù)制的延長復(fù)制的延長 1.1.聚合子代聚合子代DNADNA由由DNADNA聚合酶催化，以聚合酶催化，以3535方向的親方向的親代代DNADNA鏈為模板，從鏈為模板，從5353方向聚合子代方向

56、聚合子代DNADNA鏈。鏈。在原核生物中，參與在原核生物中，參與DNADNA復(fù)制延長的是復(fù)制延長的是DNADNA聚合酶聚合酶；在真核生物中，是在真核生物中，是DNADNA聚合酶聚合酶(延長滯后延長滯后鏈鏈) )和和（延長前導(dǎo)鏈）（延長前導(dǎo)鏈）。精選ppt 精選ppt2.2.引發(fā)體移動(dòng)引發(fā)體移動(dòng)引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙螺旋，形成新的復(fù)制叉，滯后鏈重新合螺旋，形成新的復(fù)制叉，滯后鏈重新合成成RNARNA引物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長。引物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長。 精選ppt精選ppt 三三復(fù)制的終止復(fù)制的終止 1.1.去除引物，填補(bǔ)缺口去除引物，填補(bǔ)缺口在原核生物中，由在原

57、核生物中，由DNADNA聚合酶聚合酶來水來水解去除解去除RNARNA引物，并由該酶催化延長引物引物，并由該酶催化延長引物缺口處的缺口處的DNADNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。鍵的缺口。而在真核生物中，而在真核生物中，RNARNA引物的去除，引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由段仍由DNADNA聚合酶來延長。聚合酶來延長。 精選ppt2.2.連接岡崎片段連接岡崎片段 在在DNADNA連接酶的催化下，形成最后一連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的成完整

58、的DNADNA長鏈。長鏈。 精選ppt大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體復(fù)制的終止復(fù)制的終止ori復(fù)制叉復(fù)制叉2復(fù)制叉復(fù)制叉1終止復(fù)制叉終止復(fù)制叉2終止復(fù)制叉終止復(fù)制叉1復(fù)制叉復(fù)制叉1復(fù)制叉復(fù)制叉2完成復(fù)制完成復(fù)制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶連鎖染色體連鎖染色體精選ppt四染色體多復(fù)制子復(fù)制的非一致性 原核生物在染色體DNA復(fù)制完成之前，復(fù)制起始點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)新一輪的復(fù)制起始，表現(xiàn)為多個(gè)復(fù)制叉的特點(diǎn)。 精選ppt 而真核生物染色體DNA雖多為多復(fù)制子，但每一個(gè)復(fù)制子在一個(gè)細(xì)胞周期中只啟動(dòng)一次，對每一個(gè)復(fù)制子來說，無論復(fù)制完成得早晚，都必須等待到下一個(gè)細(xì)胞周期開始后才有可能發(fā)動(dòng)新一輪復(fù)制。 精選ppt

59、成千上萬個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子看似在“同一起跑線上”，其實(shí)每個(gè)復(fù)制子發(fā)動(dòng)復(fù)制的先后時(shí)序有很大的差別。 而且這種時(shí)序的差別明顯地表現(xiàn)在同一染色體的不同復(fù)制子之間，表現(xiàn)在不同類型的細(xì)胞之間。 精選ppt 將啤酒酵母中克隆到的復(fù)制起點(diǎn)序列（ori）構(gòu)建成一個(gè)環(huán)狀的DNA分子，再導(dǎo)入到酵母細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)它可以啟動(dòng)環(huán)狀的DNA分子自主復(fù)制，將這段富含AT堿基并在不同復(fù)制子中較為保守的序列稱為自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequences，ARS）。精選ppt 果蠅受精后可檢測處于開放狀態(tài)的ARS從5000個(gè)上升到50000個(gè)，發(fā)育早起的復(fù)制子的長度僅有7.9kb，而發(fā)育到成蟲時(shí)

60、復(fù)制子的長度可以增加到40kb，可見此時(shí)許多ARS已處于關(guān)閉狀態(tài)。精選ppt 盡管這種調(diào)控的機(jī)制目前還不甚了解，但復(fù)制子變化規(guī)律表明，復(fù)制子的多少與DNA復(fù)制的速度有關(guān)，而完成全基因組的復(fù)制與細(xì)胞、組織及發(fā)育狀態(tài)有關(guān)，表現(xiàn)了多復(fù)制子復(fù)制啟動(dòng)的非一致性。精選ppt五 DNA復(fù)制的調(diào)控復(fù)制的調(diào)控 與基因表達(dá)調(diào)控一樣，DNA復(fù)制調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是起始過程的轉(zhuǎn)錄激活效率，同時(shí)細(xì)菌的培養(yǎng)試驗(yàn)表明，細(xì)菌的繁殖速率與營養(yǎng)條件（特別是氨基酸饑餓狀態(tài)對復(fù)制的影響），及多種專一性蛋白因子的濃度密切相關(guān)。精選ppt 細(xì)菌的嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒，相容性質(zhì)粒和不相容性質(zhì)粒之間的差異都表現(xiàn)在復(fù)制起始調(diào)控上，這種調(diào)控機(jī)制是自然選擇中的先后