人脂氧素A4LXA4酶聯(lián)免疫分析ELISA

1、人脂氧素A4(LXA4)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)本試劑僅供研究使用人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中脂氧素A4(LXA4的含量。試劑盒性能：1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為 0.95 以上。2. 批內(nèi)與批見(jiàn)應(yīng)分別小于 9%和 11% 檢測(cè)范圍：請(qǐng)來(lái)電咨詢保存條件及有效期：1試劑盒保存：；2-8Co2有效期： 6 個(gè)月注意事項(xiàng)：1 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2. 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試

2、驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好 控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高(樣本0D值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值)，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)( n 倍)后再測(cè)定，計(jì) 算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)(XnX 5)o5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6. 底物請(qǐng)避光保存。7. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人脂氧素

3、A4(LXA4) 水平。用純化的人脂氧素 A4(LXA4) 抗體包被微孔板， 制成固相抗體， 往包被單抗的微孔中依次加入脂氧素 A4(LXA4) ， 再與 HRP 標(biāo)記的脂氧素 A4(LXA4) 抗體結(jié)合， 形成抗體 -抗原 -酶標(biāo)抗體復(fù)合物， 經(jīng)過(guò)徹底洗 滌后加底物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終 的黃色。顏色的深淺和樣品中的脂氧素 A4(LXA4) 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定 吸光度( OD 值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人脂氧素 A4(LXA4) 濃度。樣本處理及要求 ：1. 血清： 室溫血液自然凝固 10-20分鐘，離

4、心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上 清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心20 分鐘左右( 2000-3000 轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)份）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（ PH7.2-7.4

5、）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8C的溫度。加入一定量的PBS （ PH7.4）,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于 -20 C保存，但

6、應(yīng)避免反復(fù)凍融.7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。 試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說(shuō)明書(shū)1份1份圭寸板膜2 片(48)2 片(96)密封袋1個(gè)1個(gè)酶標(biāo)包被板1X 481X 962-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品：2700ng/L0.5ml X 1 瓶0.5ml X 1 瓶2-8 C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml X 1 瓶1.5ml X 1 瓶2-8 C保存酶標(biāo)試劑3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存樣品稀釋液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑A液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存顯色劑B

7、液3 ml X 1 瓶6 ml X 1 瓶2-8 C保存終止液3ml X 1 瓶6ml X 1 瓶2-8 C保存濃縮洗滌液(20ml X 20 倍)X 1 瓶(20ml X 30 倍)X 1 瓶2-8 C保存操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 M，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 d分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d,混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 d棄掉，再各取50 d分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，

8、混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 d分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d，混勻后從第七、第八孔中分別取50 d加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 d，混勻后從第九第十孔中各取50 d棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50 d,濃度分別為 1800ng/L, 1200ng/L , 600ng/L , 300ng/L , 150ng/L ）。2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 d,然后再加待測(cè)樣品10 d （樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶

9、標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置 37 C溫育30分鐘。4. 配液：將30 （48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 （48T的20倍）倍稀釋后備用。5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50 4，空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 4，再加入顯色劑 B50 4，輕輕震蕩混勻，37 C避光顯色 15 分鐘 .10. 終止：每孔加終止液 50 4，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（ OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)