《草地貪夜蛾抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》

1、ICS65-020-01B15DB34安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 34/ XXXXX2020草地貪夜蛾抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范Guideline for insecticide resistance monitoring of the fall armyworm2020 - XX - XX發(fā)布2020 - XX - XX實(shí)施安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB/ XXXXXXXXX前言本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T1.1-2020 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)歸口單位：安徽省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)、安徽省植物保護(hù)總站、安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本

2、標(biāo)主要準(zhǔn)起草人： 操海群、李桂亭、盛成旺、李秀霞、廖敏、蔣興川、黃勇、董永成、袁松、寧偉文、黃超、鄭兆陽、徐麗娜、陳浩梁草地貪夜蛾抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了有關(guān)草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda (J.E.Smith)抗藥性監(jiān)測的術(shù)語、定義、儀器、用具、藥品及抗性測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于安徽省草地貪夜蛾發(fā)生區(qū)的抗藥性監(jiān)測。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用必不可少。凡是標(biāo)注年份的引用文件，僅所標(biāo)年份的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是未標(biāo)注年份的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T8321 農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則GB/T 19378 農(nóng)藥劑型名稱及代

3、碼GB/T 31720-2015 病媒生物抗藥性治理總則NY/T 3539-2020 葉螨抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T 2916-2016 棉鈴蟲抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T 2058-2014 水稻二化螟抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程DB65/T 3240-2011 馬鈴薯甲蟲抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語和定義GB/T8321、GB/T 19378、GB/T 31720-2015、DB65/T 3240-2011界定的下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1 發(fā)生區(qū)指安徽省已有草地貪夜蛾入侵和發(fā)生分布的地區(qū)。3.2 監(jiān)測點(diǎn)為便于比較同一地區(qū)草地貪夜蛾抗藥性不同年度間的發(fā)展動(dòng)態(tài)，確定相對固定的發(fā)生區(qū)作為監(jiān)測點(diǎn)進(jìn)行抗藥

4、性水平監(jiān)測。4 儀器、用具和化學(xué)藥劑4.1 儀器和用具0-10 L微量進(jìn)樣器，萬分之一天平，0.1-2.5 L、0.5-10 L、10 -100 L、100-1000 L移液器，1-10 mL移液管，100 mL、1000 mL量筒，500 mL燒杯，12孔培養(yǎng)板，光照培養(yǎng)箱，鑷子，毛筆，皮筋，膠帶，記號(hào)筆，標(biāo)簽紙， 1.5 mL、10 mL EP管，一次性手套等。4.2 化學(xué)藥劑氯蟲苯甲酰胺、四氯蟲酰胺、氟苯蟲酰胺、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、乙基多殺菌素、茚蟲威、虱螨脲、蟲螨腈等2020年全國草地貪夜蛾防控預(yù)案中推薦的8種應(yīng)急防治藥劑的原藥。5 抗藥性監(jiān)測5.1 監(jiān)測點(diǎn)的確定安徽省已有草地貪夜

5、蛾入侵和發(fā)生分布的地區(qū)。具體設(shè)置原則和數(shù)量如下：5.1.1 設(shè)置原則監(jiān)測點(diǎn)的設(shè)置根據(jù)安徽省玉米種植結(jié)構(gòu)結(jié)合草地貪夜蛾入侵和發(fā)生分布特點(diǎn)，在長江以南、淮河以北、以及江淮之間各個(gè)地區(qū)選擇草地貪夜蛾發(fā)生嚴(yán)重的代表性玉米種植區(qū)。5.1.2 設(shè)置數(shù)量在長江以南草地貪夜蛾遷飛過渡區(qū)選取1-2個(gè)市縣、江淮之間選取2-3個(gè)市縣、淮河以北草地貪夜蛾重點(diǎn)防治區(qū)選取3-4個(gè)市縣，每個(gè)監(jiān)測點(diǎn)面積不少于10畝。5.2 監(jiān)測時(shí)間根據(jù)安徽省草地貪夜蛾的發(fā)生規(guī)律，監(jiān)測時(shí)間為每年5月至10月。5.3 監(jiān)測方法5.3.1 試蟲的采集和飼養(yǎng)在確定的監(jiān)測點(diǎn)選取代表性玉米田3-5塊，每塊田采用“W”型五點(diǎn)取樣，每個(gè)監(jiān)測點(diǎn)采集草地貪夜蛾

6、卵塊200塊以上，或采集幼蟲、蛹500頭以上，或利用誘蟲燈誘集活成蟲200頭以上。采集的卵塊孵化后，幼蟲生長至3齡初，可直接用于生物測定。其他蟲態(tài)室內(nèi)飼養(yǎng)至F1代3齡初幼蟲用于生物測定。飼養(yǎng)條件為（26±1），相對濕度為40-70%，光周期L/D= 16h/8h，幼蟲采用人工飼料飼養(yǎng)，人工飼料的配方如附錄A所示，成蟲飼喂10%蜂蜜水。5.3.2 藥劑的配制用電子天平準(zhǔn)確稱取一定量的殺蟲劑原藥，用丙酮或二甲基亞砜等有機(jī)溶劑溶解，配制成母液。如果采用飼料混毒法，可使用同一溶劑稀釋母液，配制系列濃度的工作液，再與人工飼料按照質(zhì)量比1:99均勻混合，藥液量不少于2 g；若采用點(diǎn)滴法，用同一溶

7、劑將母液稀釋為系列濃度的工作液，每個(gè)濃度藥液量不少于2 mL；若采用浸葉法，將母液用0.1% Triton-100水溶液梯度稀釋至工作液濃度，每個(gè)濃度藥液量不少于400 mL。5.3.3 測定方法的選擇根據(jù)防治藥劑的作用特點(diǎn)和作用方式，選擇飼料混毒法、點(diǎn)滴法和浸葉法等。2020年全國草地貪夜蛾防控預(yù)案中推薦的8種應(yīng)急防治藥劑的抗性監(jiān)測推薦方法見附錄D，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：5.3.3.1 飼料混毒法選取生長一致、健康的3齡初幼蟲作為試蟲。在24孔培養(yǎng)板的每孔加入適量（注：最好明確大約幾克）混毒人工飼料，并接入1頭試蟲。12頭為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度重復(fù)3次；每個(gè)藥劑設(shè)置5-7個(gè)濃度梯度。以添加相同質(zhì)量

8、溶劑處理的飼料作為對照。處理后將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至（26±1）、相對濕度為40-70%、光周期L/D= 16h/8h的條件下飼養(yǎng)。5.3.3.2 點(diǎn)滴法選取生長一致、健康的3齡初幼蟲作為試蟲。用微量點(diǎn)滴器將0.2 L供試藥液點(diǎn)滴在3齡幼蟲的胸部背板，從低濃度到高濃度依次處理。12頭試蟲為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度重復(fù)三次，每個(gè)藥劑設(shè)置5-7個(gè)濃度梯度。以點(diǎn)滴相同體積有機(jī)溶劑的試蟲作為對照。處理后的試蟲轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板飼養(yǎng)，每孔1頭，并加入適量人工飼料或新鮮玉米葉片，于（26±1）、相對濕度為40-70%、光周期L/D= 16h/8h的條件下飼養(yǎng)。5.3.3.3 浸葉法選取生長一致、健康

9、的3齡初幼蟲作為試蟲。采集未接觸任何農(nóng)藥的新鮮玉米葉片，用打孔器打成直徑略小于12孔培養(yǎng)板孔徑的葉碟，浸入待測藥液中10 s，取出置于吸水紙自然晾干后轉(zhuǎn)至12孔培養(yǎng)板，每孔放入？個(gè)葉碟，接入1頭試蟲。12頭試蟲為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度重復(fù)三次，每個(gè)藥劑設(shè)置5-7個(gè)濃度梯度。以含有相體積同溶劑的0.1% Triton-100水溶液處理的葉碟飼喂組為對照。處理后的試蟲于（26±1）、相對濕度為40-70%、光周期L/D= 16h/8h的條件下飼養(yǎng)。5.3.4 藥劑處理后的檢查時(shí)間參照NY/T 2058-2014和DB65/T 3240-2011，根據(jù)藥劑發(fā)揮作用的快慢確定檢查時(shí)間。對于作用迅

10、速的殺蟲劑如茚蟲威、蟲螨腈、氯蟲苯甲酰胺、氟苯蟲酰胺和四氯蟲酰胺，處理后48h檢查結(jié)果；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽和乙基多殺菌素處理后72 h檢查結(jié)果；虱螨脲處理后96 h檢查。5.3.5 試蟲的死亡標(biāo)準(zhǔn)試蟲觸碰無反應(yīng)或不能協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，或處理組草地貪夜蛾體長明顯小于對照組體長一半以上，即判定為死亡。5.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析5.3.6.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)將調(diào)查數(shù)據(jù)填于附錄B中表格。5.3.6.2 統(tǒng)計(jì)分析利用SAS、SPSS、POLOplus、等軟件，采用濃度對數(shù)-機(jī)率值分析法，計(jì)算LC50值及其95%置信限、斜率±標(biāo)準(zhǔn)誤（b±SE）、卡方值和自由度，記錄于附錄C的表中。5.3.7 抗

11、性水平的判斷5.3.7.1 抗性倍數(shù)的計(jì)算參照NY/T 3539-2020、NY/T 2916-2016和NY/T 2058-2014標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算公式如下：根據(jù)敏感品系的LC50值和監(jiān)測地區(qū)種群的LC50值，按公式（3）計(jì)算監(jiān)測地區(qū)種群的抗性倍數(shù)。RR=TS （3）式中：RR監(jiān)測地區(qū)種群的抗性倍數(shù)；T監(jiān)測地區(qū)種群的LC50值；S敏感品系的LC50值。5.3.7.2 抗性水平的評估參照NY/T 3539-2020、NY/T 2916-2016和NY/T 2058-2014標(biāo)準(zhǔn)，抗性分級標(biāo)準(zhǔn)表如下表1：表1 抗藥性水平的分級標(biāo)準(zhǔn)抗藥性水平等級抗性倍數(shù)RR低水平抗性5.0<RR10.0中等水平抗

12、性10.0<RR100.0高水平抗性RR>100.0 附錄A（資料性附錄）草地貪夜蛾人工飼料配方A.1 A組份分別稱取黃豆粉100 g，麥麩80 g，酵母粉26 g，干酪素8 g，抗壞血酸8 g，加入蒸餾水500 mL充分?jǐn)嚢杈鶆?。A.2 B組份稱取瓊脂26 g，加入蒸餾水400 mL，充分?jǐn)嚢杈鶆?。A.3 C組分分別稱取氯化膽堿1 g，山梨酸2 g，肌醇0.2 g，青霉素鈉0.1 g，尼泊金甲酯2 g，加入蒸餾水100 mL充分?jǐn)嚢杈鶆?。A.4 將B組中的瓊脂與蒸餾水混合物倒入燒杯中煮至沸騰，然后加入A組，繼續(xù)煮至沸騰。A.5 煮沸后冷卻至70-80，加入C組并攪拌均勻。A.6

13、待冷卻至50-60，加入微量元素組合4 mL，并攪拌均勻。 微量元素組合 煙酰胺(Nicotianamine) 2086 mg 泛酸鈣(Calcium pantothenate) 2086 mg 核黃素（Riboflavin） 1059 mg 鹽酸硫胺素（Thiamine hydrochloride） 524 mg 鹽酸吡哆醇（Pyridoxine hydrochloride） 524 mg 葉酸（Folic acid） 524 mg 生物素（Biotin） 51 mg 鈷胺素（Cobalamin,vitamin B12） 13 mg 準(zhǔn)確稱取以上各組分，加入蒸餾水160 mL，并用玻璃棒攪拌

14、混勻，用移液槍吸取4 mL分裝保存于-20備用。A.7 將配制完成的飼料倒入飼料盒（16.7cm×12.3cm×6cm）中，待飼料冷卻后蓋上保鮮膜，置于4冰箱保存。附錄B（資料性附錄）草地貪夜蛾抗性監(jiān)測調(diào)查表表B.某種藥劑對草地貪夜蛾生物測定原始數(shù)據(jù)表測定時(shí)間： 種群測試蟲態(tài)： 測定紀(jì)錄人： 藥劑劑量或濃度（g/頭或mg/L）重復(fù)組處理的總蟲數(shù)（頭）處理后的死亡蟲數(shù)（頭）CK123A1123A2123A3123A4123A5123A6123A7123附錄C（資料性附錄）草地貪夜蛾抗性監(jiān)測結(jié)果表C.草地貪夜蛾抗性監(jiān)測結(jié)果測定時(shí)間： 測定紀(jì)錄人： 藥劑種群（監(jiān)測點(diǎn)）毒力回歸線（y=a+bx）LC50及95%置信限（g/頭或mg/L）斜率±標(biāo)準(zhǔn)誤卡方值（自由度）抗性倍數(shù)ABCD附錄D（資料性附錄）草地貪夜蛾抗性監(jiān)測方法的選擇根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)部草地貪夜蛾應(yīng)急防治用藥推薦名單藥劑，推薦相應(yīng)的生物測定方法藥劑作用靶標(biāo)作用方式推薦