微生物膿汁糞便實驗報告

1、醫(yī)學微生物學實驗報告一、實驗題目：膿汁和糞便標本中病原菌的檢測二、實驗目的：1、了解細菌生長的基本營養(yǎng)條件。熟悉培養(yǎng)基的種類。掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。了解理化因素對細菌的影響。掌握常用的消毒滅菌法和無菌操作技術(shù)。2、掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。了解并比較細菌在固體、半固體及液體培養(yǎng)基上的生長特征。3、掌握油鏡的正確使用、細菌涂片標本的制備。掌握革蘭氏染色法。熟悉細菌的基本形態(tài)。了解細菌的特殊結(jié)構(gòu)。熟悉幾種常用的細菌生化反應的名稱、原理、方法、結(jié)果分析及用途。掌握血漿凝固酶試驗的原理、方法及用途。掌握玻片凝集試驗的原理、方法、結(jié)果觀察與判斷。熟悉藥物敏感性試驗方法的種類、原理及應用。掌握

2、紙片擴散法。三、實驗器材接種環(huán)，接種針，酒精燈，膿汁標本1支，糞便標本1支，碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科鑷子2把，伊紅美蘭平板，營養(yǎng)瓊脂平板；斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯，生理鹽水，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張，半固體瓊脂培養(yǎng)基，糖發(fā)酵管1套，抗菌素紙片1套，藥敏試驗培養(yǎng)物4個四、方法與步驟 4.1實驗原理 （1）、培養(yǎng)基制備：用人工方法將微生物生長繁殖所需要的多種營養(yǎng)物質(zhì)，按比例混合配制而成的營養(yǎng)制品，其主要用途是分離培養(yǎng)純種微生物，傳代或保存微生物，鑒別微生物的種屬，研究微生物的生理及生化特性。 （2）、細菌的分離與培養(yǎng)：細菌學檢驗，特別是細菌培養(yǎng)必須是無菌操作。細菌的接種技

3、術(shù)主要有：平板劃線分離法，斜面、液體或半固體培養(yǎng)基接種法。為避免在接種過程中污染環(huán)境和空氣中的細菌污染培養(yǎng)物，要求在酒精燈旁進行細菌接種。采用一般培養(yǎng)法即需氧培養(yǎng)法，將已接種好的培養(yǎng)基置于37恒溫箱中培養(yǎng)1824小時，一般細菌即可在培養(yǎng)基中生長繁殖。 （3）、半固體培養(yǎng)基接種法(穿刺接種法)：不同的細菌生長在一定的培養(yǎng)基上往往有不同的特征，因此，培養(yǎng)特征可以作為細菌分類鑒定的重要依據(jù)。 （4）、細菌個體形態(tài)特征的觀察：細菌是一類具有細胞壁的單細胞微生物，在一定環(huán)境下有相對恒定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。盡管細菌菌落肉眼可見，但要觀察單個細菌細胞，必須借助光學顯微鏡將其放大9001000倍在微生物學中主要使用的

4、是油鏡。油鏡是因為在使用時需要香柏油作介質(zhì)而得名。細菌菌體在強光下呈透明或半透明，其折光系數(shù)與玻璃片相似，在光學顯微鏡下難以看清楚，所以，必須將細菌制成涂片，固定后，用化學染料使菌體著色，從而和周圍背景產(chǎn)生鮮明對比，才能觀察到細菌的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。復染法，即鑒別染色法，是用兩種或兩種以上染料，可將細菌染成不同的顏色，用于協(xié)助鑒別細菌。常用的復染法有革蘭氏染色法和抗酸染色法。革蘭氏染色法將細菌分成兩大類：革蘭陽性(G+)菌和革蘭陰性(G-)菌。 （5）、細菌生化反應鑒定：血漿凝固酶試驗：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，能使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔等動物血漿發(fā)生凝固，凝固的血漿沉積于菌體表面，

5、阻礙吞噬細胞的吞噬，或即使被吞噬，血漿凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標。糖發(fā)酵試驗：單糖發(fā)酵微量管是只含有一種糖(如葡萄糖、乳糖)的pH7.6的蛋白胨水，并加入一定量的指示劑。接種細菌經(jīng)培養(yǎng)后，若該菌具有分解該糖的酶，有酸產(chǎn)生時就能使指示劑變色。如指示劑為酸性復紅pH4.2(紅色)6.2(黃色)，則變成紅色；溴甲酚紫pH5.2(黃色)6.8(紫色)則呈黃色。若有氣體產(chǎn)生，則微量管內(nèi)集聚氣泡。 （6）、細菌血清學鑒定：血清學反應是指抗原抗體在體外的特異性結(jié)合反應，可用已知抗原檢測未知抗體或用已知抗體檢測未知抗原。常見的有凝集反應、沉淀反應、補體結(jié)合反應和中和反應等。血清學反應常用于傳染病

6、的診斷和微生物菌株的鑒定。將已知的抗體(診斷血清)直接與未知的顆粒性抗原物質(zhì)(如細菌)混合，在有適當電解質(zhì)存在條件下，如兩者對應便發(fā)生特異性結(jié)合而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對應便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性，稱為直接凝集反應，屬定性試驗，有玻片法和試管法兩種，主要用于檢測抗原，如菌種的鑒定與分型、ABO血型鑒定等。 （7）、細菌藥物敏感性試驗：紙片擴散法：是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴散滲透作用，將含已知濃度的藥物濾紙片貼于含有敏感性試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，抗生素就自紙片向平板四周擴散滲透，在抑菌濃度所達范圍內(nèi)敏感菌的生長被抑制而出現(xiàn)抑菌圈，通過比較抗生素濃度與抑菌圈的大小以測定抗生素的

7、抑菌濃度。 4.2實驗步驟 （1）培養(yǎng)基制備的一般程序：調(diào)配溶化 矯正pH 分裝滅菌檢定保存。干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝滅菌檢定保存。 （2）、細菌的分離與培養(yǎng)：細菌的分離：燒灼滅菌接種環(huán)分別取膿汁標本與糞便標本點在普通平板和依紅美藍平板上，各做兩份燒灼接種環(huán)上的多余的標本在平板上劃曲線移動平板依次劃五區(qū)：從原涂抹部分開始，連續(xù)平行劃線，每次只劃平板的1/41/5，劃畢后接種環(huán)再經(jīng)火焰滅菌，冷卻后用同樣方法在平板其余部分劃線，每次劃線要與前次劃線重疊13條，共計34次(區(qū))接種環(huán)燒灼滅菌平板倒置，做好標記37培養(yǎng)18-24小時備用。細菌純培養(yǎng)：先觀察上述實驗中平板分離出來的菌落接種環(huán)燒灼滅菌

8、挑選平板上典型的四種單菌落（白色、黃色、紫黑色、粉紅色）進行斜面接種純培養(yǎng)，并做好標記接種環(huán)燒灼滅菌培養(yǎng)不得超過18小時保存?zhèn)溆?。液體培養(yǎng)基接種：接種環(huán)燒灼滅菌分別取斜面培養(yǎng)實驗中培養(yǎng)得到的四種菌苔適量接種到液體培養(yǎng)基中接種環(huán)燒灼滅菌35培養(yǎng)4-6小時，備用。半固體培養(yǎng)基接種法(穿刺接種法)：右手握接種針，滅菌冷卻后，挑取菌苔少許，垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)基的中心，可刺達近管底處，但不要達于管底，然后沿原路退出接種完畢，試管口迅速通過火焰23次滅菌，塞好棉塞。接種針燒灼后方可放下斜面培養(yǎng)基管置于37培養(yǎng)過夜。 （4）、細菌個體形態(tài)特征的觀察：觀察細菌在固體培養(yǎng)基上生長特征平板菌落特征細菌在瓊脂平

9、板上培養(yǎng)一定時間后，形成菌落。各種細菌菌落都有一定的特點，表現(xiàn)在以下幾方面：1 大?。捍?直徑約3mm以上)，中(直徑約13mm)，小(直徑約1mm以下)。2 形狀：圓形，卵圓形、假根形、絲狀、不規(guī)則等。3 邊緣：整齊，鋸齒狀，波浪狀，羽毛狀。4 表面：隆起、平坦、中心凸起、臍形凹陷；光滑或粗糙、濕潤或干燥。5 溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周圍呈草綠色、不透明)，溶血(菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)) 色素：一般為無色或灰白色，特殊色素有兩類：脂溶性色素(菌落本身著色，培養(yǎng)基不著色)和水溶性色素(菌落及培養(yǎng)基均著色)。斜面菌苔的特征：不同的細菌在斜面培養(yǎng)基上生長，往往也具有一定的特征，表現(xiàn)在生長量、菌

10、苔形狀(如線狀、念珠狀、假根狀、薄膜狀等)、表面形狀、光澤、透明度、顏色等方面。細菌在液體培養(yǎng)基中生長特征的觀察細菌在液體培養(yǎng)基中生長可出現(xiàn)肉眼可見的各種特征，如培養(yǎng)液渾濁或澄清，出現(xiàn)形態(tài)不一(如絮狀、塊狀等)的沉淀，或在培養(yǎng)基表面形成菌膜(薄膜、厚膜或僅沿管壁產(chǎn)生一圈菌膜即菌環(huán)等)。細菌在半固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察不同的細菌經(jīng)半固體培養(yǎng)基穿刺接種后生長情況不同。能運動的細菌，往往沿穿刺線擴散生長(即有動力)，而使穿刺線周圍出現(xiàn)模糊或混濁；不能運動的細菌僅沿穿刺線生長；嚴格好氧菌僅表面生長，兼性厭氧菌沿整個穿刺線生長。 （5）、細菌生化反應鑒定：細菌涂片制備：取潔凈的載玻片一張，用在火焰上燒

11、過的接種環(huán)取生理鹽水12環(huán)于玻片上。接種環(huán)滅菌后，挑取細菌培養(yǎng)物少許與鹽水輕輕磨勻，涂抹成直徑1厘米大小的均勻薄膜。臨床標本如膿汁、痰、分泌物等可直接涂片干燥：涂片最好在室溫中自然干燥，必要時可將涂片膜面向上，小心間斷地在弱火高處略烘，以助水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后難以檢查革蘭染色法步驟：固定：手持玻片的一端，標本面朝上，在火焰外層快速地來回通過23次，共約23秒，使標本固定，即可進行染色初染：在已固定的細菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液12滴，經(jīng)1分鐘后用細流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水媒染：加蘆戈氏碘液12滴，經(jīng)1分鐘后用細流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水。媒染劑的作用是增加染料和

12、細胞之間的親和性或附著力，不易脫落脫色：滴加95%酒精數(shù)滴，輕輕搖動玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉的染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精無色或稍淡紫色為止(約需2030秒)，立即用細流水將酒精沖掉，并傾去玻片上余水復染：加稀釋復紅12滴，經(jīng)30秒1分鐘后用細流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水。標本涼干后，滴加香柏油，用油鏡觀察，革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。糖酵解試驗。用接種針分別挑少許紫黑和粉紅色的細菌接種到葡萄糖發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管中。將微量管平放在平皿蓋內(nèi)，在37下，培養(yǎng)24小時，觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。五血漿凝固酶試驗：取干凈玻片一塊，用計號筆將玻片分為兩格，其

13、中一格加兔血漿12滴，另一格加生理鹽水1滴將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌冷卻后，取細菌新鮮培養(yǎng)物少許，在生理鹽水中研磨混勻成細菌懸液用滅菌接種環(huán)取細菌懸液1環(huán)，或挑取細菌培養(yǎng)物少許，在兔血漿中輕輕磨勻稍待片刻，觀察結(jié)果結(jié)果判斷：先觀察生理鹽水對照，應呈均勻混濁現(xiàn)象。再觀察細菌與兔血漿混合物，若有凝塊出現(xiàn)，則為陽性；無凝塊出現(xiàn)為陰性。 （6）、細菌血清學鑒定：血漿凝固酶試驗。：取二滴兔血漿置于潔凈的玻片上接種環(huán)燒灼滅菌分別用接種環(huán)取斜面純化培養(yǎng)所得到的白色和黃色菌苔與血漿研磨混合邊混勻邊觀察結(jié)果接種環(huán)燒灼滅菌觀察結(jié)果。玻片凝集實驗：取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設為對照區(qū)，滴加生理鹽水15ul。

14、遠端設為試驗區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清15ul用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，約12個小菌落的菌量，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻如上述混合懸液由均勻混濁變?yōu)槌吻逋该鳎⒊霈F(xiàn)大小不等的乳白色凝集塊者即為陽性；如混合物仍呈均勻混濁則為陰性者，可認為陰性。（7）、細菌藥物敏感性試驗：接種環(huán)分別取菌液2環(huán)，各自在四個平板上，作平板密集劃線接種細菌（紗窗樣）。設計三點，三點之間等邊三角距離，點距離平皿邊緣約15mm。作標記：青、鏈、慶。鑷子火焰消毒，夾取相應的藥物紙片，平貼在已設定的位置上，按壓，最后鑷子火焰滅菌。371824小時培養(yǎng)，觀察結(jié)果。五、結(jié)果與討論（1）細菌分離培養(yǎng)特點： 圖一 膿汁標本分離培養(yǎng)出

15、現(xiàn)黃色和白色兩種菌落 圖二 糞便標本分離培養(yǎng)的紫黑色和粉紅色菌落（2）斜面培養(yǎng)基接種培養(yǎng)結(jié)果 圖三 粉紅色菌落斜面接種結(jié)果 圖四 紫黑色菌落斜面接種結(jié)果（3）、.革蘭氏染色后顯微鏡下的鏡檢結(jié)果： 圖五 糞便標本革蘭染色法涂片鏡檢 圖六 膿汁標本革蘭染色法涂片鏡檢 鏡檢結(jié)果：標本膿汁標本糞便標本菌落顏色黃色白色紫黑色帶金屬光澤粉紅色半透明形態(tài)革蘭陽性球菌,排列不規(guī)則，呈葡萄串狀革蘭陰性桿菌，散在排列結(jié)果典型的葡萄球菌；結(jié)合菌落顏色，黃色的是金黃色葡萄球菌，白色的是白色葡萄球菌從形態(tài)上不能鑒別是什么細菌表一 革蘭染色法鏡檢結(jié)果(4)、細菌生化反應和血清學鑒定結(jié)果 圖七 血漿凝固酶試驗 圖八 玻片凝

16、固劑試驗實驗血漿凝固酶試驗玻片凝集試驗種類白色球菌（左）+兔血清黃色球菌（右）+兔血清粉紅色桿菌+生理鹽水（左）粉紅色桿菌+福氏志賀菌診斷血清（右）結(jié)果白色球菌與兔血清少量凝集（+）黃色球菌與兔血清凝集現(xiàn)象較明顯，有明顯白色凝集物（+）粉紅色菌落的桿菌與生理鹽水無反應（-），但與福氏志賀菌診斷血清凝集（+）表二 血漿凝固酶和玻片凝集試驗結(jié)果 圖九 糖酵解實驗，從左至右依次：紫黑色菌苔葡萄糖發(fā)酵及乳糖發(fā)酵，粉紅色菌苔葡萄糖發(fā)酵及乳糖發(fā)酵圖十 紙片擴散法 從左往右：金黃色、白色、紫黑色、粉紅色菌與青霉素、慶大霉素、頭孢曲松藥敏結(jié)果 圖十一 紫黑色菌落菌半固體穿刺實驗 圖十二 粉紅色菌半固體穿刺實驗

17、 標本菌落形態(tài)血漿固酶葡萄糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵半固體福痢血清青霉素鏈霉素慶大霉素結(jié)論膿汁標本黃色G+球菌+金黃色葡萄球菌白色G+球菌-+白色葡萄球菌糞便標本紫黑G-桿菌+-+大腸埃希菌粉紅G-桿菌-+-+福氏志賀菌表三 結(jié)果匯總（5）、實驗討論實驗比較成功，結(jié)果符合客觀事實。但在平板劃線法涂布菌液時用力過猛劃破培養(yǎng)基，且一區(qū)所占面積較大影響了五區(qū)，導致最后培養(yǎng)出來的單菌落較少。以后實驗要熟練平板劃線法。用油鏡（6）注意事項1、在革蘭染色的操作當中，所取得菌量不能太多，如果取得太多的菌量會在鏡檢時看到細菌與細菌之間重疊，分布過于密集，常常會導致假陽性的出現(xiàn)。另外，革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程

18、度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌：而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。因此應該要操作迅速，控制在30秒以內(nèi)。此外，染色時通常會用新鮮的細菌培養(yǎng)物，因為菌齡會影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。2、在糖發(fā)酵試驗當中，存放的時間不應過長，否則會使產(chǎn)氣的微量發(fā)酵管的氣體排出，導致所看到的現(xiàn)象不準確。3、在操作動力實驗的過程中，接種針應該要順著原路退出，如果此過程中接種針左右擺動了，會出現(xiàn)本沒有鞭毛的細菌經(jīng)培養(yǎng)呈現(xiàn)一片渾濁，難以判斷是操作有誤還是細菌的運動所致。4、實驗的各個環(huán)節(jié)都要嚴格進行無菌操作如果無菌操作不嚴格，會產(chǎn)生雜菌影響實驗結(jié)果。每次取菌(或接種)前后，均須燒灼接種工具，接種完畢，不能直接將接種環(huán)在火焰中燒灼，以免環(huán)上的細菌或標本因受高熱爆烈四濺，應先將細菌或標本烤干后再燒灼。不要劃破瓊脂表面。5、注意無菌操作，防止空氣中微生物掉入平板中造成污染。