第三章高效液相色譜分析ppt課件

1、第三章第三章 液相色譜法簡(jiǎn)介液相色譜法簡(jiǎn)介3.1高效液相色譜分析法的特點(diǎn)高效液相色譜分析法的特點(diǎn)1. 高壓高壓 采用高壓泵使流動(dòng)液能迅速經(jīng)過色譜柱，采用高壓泵使流動(dòng)液能迅速經(jīng)過色譜柱，普通達(dá)普通達(dá)150105 350 105 Pa。2. 高速高速 高壓帶來高速，分析時(shí)間普通少于高壓帶來高速，分析時(shí)間普通少于lh。3. 高效高效 柱效能約可達(dá)柱效能約可達(dá)3萬塔板萬塔板/米米GC的柱效約為的柱效約為2000/米。米。4. 高靈敏度高靈敏度 由于采用了高靈敏度的檢測(cè)器，最小由于采用了高靈敏度的檢測(cè)器，最小檢丈量可達(dá)檢丈量可達(dá)10-9 g，甚至，甚至10-11 g。5. 可用于高沸點(diǎn)的、不能氣化的、熱

2、不穩(wěn)定的以及可用于高沸點(diǎn)的、不能氣化的、熱不穩(wěn)定的以及具有生理活性物質(zhì)的分析具有生理活性物質(zhì)的分析 二、二、HPLCHPLC與與GCGC差別差別 1分析對(duì)象的區(qū)別 GC： 適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品； 但對(duì)高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型 及高聚物的樣品，尤其對(duì)大多數(shù)生化樣品不可 檢測(cè)。(占有機(jī)物的20%) HPLC： 適于溶解后能制成溶液的樣品包括有機(jī)介質(zhì)溶 液，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對(duì)分 子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分 子和離子型樣品均可檢測(cè)用途廣泛。占有機(jī)物 的80%2 2流動(dòng)相的區(qū)別流動(dòng)相的區(qū)別GCGC：流動(dòng)相為惰性，氣體組分與流動(dòng)相無親協(xié)作用：

3、流動(dòng)相為惰性，氣體組分與流動(dòng)相無親協(xié)作用 力，只與固定相有相互作用。力，只與固定相有相互作用。 HPLCHPLC：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有親協(xié)作用：流動(dòng)相為液體，流動(dòng)相與組分間有親協(xié)作用 力，能提高柱的選擇性、改善分別度，對(duì)分別起力，能提高柱的選擇性、改善分別度，對(duì)分別起 正向作用。且流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣，改正向作用。且流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣，改 變流動(dòng)相極性和變流動(dòng)相極性和pHpH值也對(duì)分別起到調(diào)控作用，當(dāng)值也對(duì)分別起到調(diào)控作用，當(dāng) 選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相 也可以增大分別選擇性。也可以增大分別選擇性。3 3操作條件

4、差別操作條件差別GCGC：加溫操作：加溫操作HPLCHPLC：室溫；高壓液體粘度大，峰展寬?。菏覝兀桓邏阂后w粘度大，峰展寬小 可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)展分析。 稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動(dòng)相：流動(dòng)相：20%甲醇甲醇-水水100%甲醇甲醇 線性梯度淋洗，線性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 溫：溫：50 C 柱柱 壓：壓：70 104 Pa 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器第二節(jié)第二節(jié) 影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分別的要素影響色譜峰擴(kuò)展及色譜分別的要素 影響分別的主要要素有流動(dòng)相的流量、

5、影響分別的主要要素有流動(dòng)相的流量、性質(zhì)和極性。性質(zhì)和極性。 在高效液相色譜中, 速率方程中的分子分散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，而只需兩項(xiàng)，即： H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的外形不同，如下圖：1流速：流速大于流速：流速大于0.5 cm/s時(shí)時(shí), Hu曲線是曲線是一段斜率不大的直線。一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)踐操作是很大。但在實(shí)踐操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分別度和出峰時(shí)間的重分別度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。要可選擇參數(shù)。(2) 液體的粘度比氣體大一百倍液體的粘度比氣體大一百倍,密度為氣體的一千倍密度為

6、氣體的一千倍,故降低傳質(zhì)阻力是故降低傳質(zhì)阻力是LC中提高柱效的主要途徑。中提高柱效的主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色譜中，不能夠經(jīng)過添加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫 改動(dòng)淋洗液組成、極性是改善分別的最直接的要素。1分別原理：利用組分分子占據(jù)固定相外表吸附分別原理：利用組分分子占據(jù)固定相外表吸附 活性中心才干的差別活性中心才干的差別 分別前提：分別前提：K不等或不等或k不等不等一、液固吸附色譜法一、液固吸附色譜法LSC 流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑2 2固定相固定相分為極性和非極性兩類分為極性和非極性兩類極性固定相：極性固定相： 硅膠、氧化鋁和

7、氧化鎂、硅酸鎂分子篩等，其硅膠、氧化鋁和氧化鎂、硅酸鎂分子篩等，其 中極性硅膠運(yùn)用最普遍。中極性硅膠運(yùn)用最普遍。非極性固定相：非極性固定相： 多孔微?；钚蕴肌⒍嗫资亢?，以及高分多孔微?；钚蕴?、多孔石墨化炭黑，以及高分 子多孔微球等。子多孔微球等。1 1硅膠：硅膠： 無定型硅膠無定型硅膠 最早運(yùn)用，傳質(zhì)慢、柱效低最早運(yùn)用，傳質(zhì)慢、柱效低薄殼型硅膠薄殼型硅膠 直徑為直徑為3040m3040m的玻璃珠外表涂布一層的玻璃珠外表涂布一層12m12m 厚的硅膠微粒，孔徑均一、浸透性好、傳厚的硅膠微粒，孔徑均一、浸透性好、傳質(zhì)質(zhì) 快，但柱容量有限?？?，但柱容量有限。全多孔球型硅膠全多孔球型硅膠 粒度普

8、通為粒度普通為510m510m，顆粒和孔徑的均一性，顆粒和孔徑的均一性都比都比 前兩種好，柱容量大，為當(dāng)今液固色譜固前兩種好，柱容量大，為當(dāng)今液固色譜固定相定相 的主體，也是鍵合固定相的主要基質(zhì)。的主體，也是鍵合固定相的主要基質(zhì)。原理原理- -吸附吸附 特點(diǎn)特點(diǎn)- -峰易拖尾峰易拖尾 適用適用- -分別極性化合分別極性化合物物2 2高分子多孔小球：高分子多孔小球： 特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低 適用：分別弱極性化合物適用：分別弱極性化合物3 3流動(dòng)相流動(dòng)相 除了最根本的要求之外，主要思索溶劑強(qiáng)除了最根本的要求之外，主要思索溶劑強(qiáng)度，溶解度參數(shù)及極性參數(shù)等。度

9、，溶解度參數(shù)及極性參數(shù)等。1 1分別原理：利用組分在兩相中溶解度的差別分別原理：利用組分在兩相中溶解度的差別2 2固定相：載體固定相：載體+ +固定液物理或機(jī)械涂漬法缺固定液物理或機(jī)械涂漬法缺 點(diǎn)是固定液層的耐溶劑沖刷性能差，固點(diǎn)是固定液層的耐溶劑沖刷性能差，固 定液易流失，從而導(dǎo)致柱效降低，被鍵定液易流失，從而導(dǎo)致柱效降低，被鍵 合相填料所取代。合相填料所取代。3 3正相色譜正相色譜- -固定液極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性NLLCNLLC 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱，極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱，適于分別極性組分。適于分別極性組分。 反相色譜反相色譜- -固定液

10、極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性RLLCRLLC 極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分別非極性組分。于分別非極性組分。二、液液分配色譜法二、液液分配色譜法LLC 鍵合相色譜根本上屬于分配色譜，與液液分鍵合相色譜根本上屬于分配色譜，與液液分配色譜固定相不同的是配色譜固定相不同的是“固定液以化學(xué)鍵的方固定液以化學(xué)鍵的方式與載體結(jié)合在一同的。式與載體結(jié)合在一同的。常規(guī)化學(xué)鍵合相常規(guī)化學(xué)鍵合相利用化學(xué)反響將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體外表利用化學(xué)反響將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體外表 1 1分別機(jī)制：分配分別機(jī)制：分配+ +吸附以吸附以LLCLLC為根底為根

11、底 2 2特點(diǎn)：特點(diǎn)： 不易流失不易流失 熱穩(wěn)定性好熱穩(wěn)定性好 化學(xué)性能好化學(xué)性能好 載樣量大載樣量大 適于梯度洗脫適于梯度洗脫4.4.化學(xué)鍵合相色譜化學(xué)鍵合相色譜CPCCPC三、離子色譜法三、離子色譜法IC1. 1. 離子交換色譜離子交換色譜 凡在溶液中可以電離的物質(zhì)，通常都可以用離子凡在溶液中可以電離的物質(zhì)，通常都可以用離子交換色譜法進(jìn)展分別，其主要根據(jù)固定相對(duì)待測(cè)離子交換色譜法進(jìn)展分別，其主要根據(jù)固定相對(duì)待測(cè)離子對(duì)的親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分別。對(duì)的親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分別。固定相類型：強(qiáng)陽離子交換劑如磺酸基固定相類型：強(qiáng)陽離子交換劑如磺酸基 強(qiáng)陰離子交換劑如季胺基強(qiáng)陰離子交換劑如季胺基 弱陽離

12、子交換劑如羧基弱陽離子交換劑如羧基 弱陰離子交換劑如氨基弱陰離子交換劑如氨基流動(dòng)相以水相緩沖液為主，有時(shí)加少量有機(jī)改性劑。流動(dòng)相以水相緩沖液為主，有時(shí)加少量有機(jī)改性劑。 離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期開展起來的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。2. 2. 離子色譜法離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分別方法。是由離子交換色譜法派生出來的一種分別方法。3. 3. 離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜 離子對(duì)色譜是一種分分別子型化合物的特殊分離子對(duì)色譜是一種分分別子型化合物的特殊分離方

13、式。離方式。 采用非極性固定相分別弱酸或弱堿等可離子化采用非極性固定相分別弱酸或弱堿等可離子化的物質(zhì)時(shí)，因其在固定相上的保管作用很弱，不易的物質(zhì)時(shí)，因其在固定相上的保管作用很弱，不易分別。故在流動(dòng)相中加一種與被分析物極性相反的分別。故在流動(dòng)相中加一種與被分析物極性相反的離子離子對(duì)試劑，使其與被分析物構(gòu)成締合離子離子對(duì)試劑，使其與被分析物構(gòu)成締合物，從而添加保管，提高分別度。物，從而添加保管，提高分別度。四、排阻色譜色譜四、排阻色譜色譜size- exclusion chromatography 固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分別。小分子可以分散到凝膠空隙，由其中經(jīng)過，

14、出峰最慢；中等分子只能經(jīng)過部分凝膠空隙，中速經(jīng)過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰； 可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分別 五、五、 親和色譜親和色譜(AC) Affinity chromatograph 原理：利用生物大分子和固定相外表存在的某種特異性親和力，進(jìn)展選擇性分別。 先在載體外表鍵合上一種具有普通反響性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再銜接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保管。改動(dòng)淋洗液后洗脫。六、分別類型選擇六、分別類型選擇 choice of separation

15、 types 首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分別的樣品時(shí)，譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分別的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)展分流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)展分別，然后依先后順序進(jìn)入別，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來，由送出的信號(hào)記錄下來，由此得到液相色譜圖。此得到液相色譜圖。 此外還配有自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處置等輔助安裝。此外還配有自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處置等輔助安裝。 儀器組成儀器組成高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分

16、別系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)數(shù)據(jù)處置系統(tǒng)溶劑貯液瓶溶劑貯液瓶v用途：儲(chǔ)存流動(dòng)相溶劑用途：儲(chǔ)存流動(dòng)相溶劑v資料：玻璃或塑料，無色或棕色，資料：玻璃或塑料，無色或棕色，v容積：約為容積：約為0.52.0Lv位置：高于泵，以保一定的輸液靜壓差。位置：高于泵，以保一定的輸液靜壓差。 1.高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng) 高壓輸液泵高壓輸液泵v是是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。系統(tǒng)中最重要的部件之一。v輸液泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)輸液泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備的性能輸液泵應(yīng)具備的性能流量穩(wěn)定。對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。流量穩(wěn)定。對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至

17、關(guān)重要。流量范圍寬，分析型應(yīng)在流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.110 ml/min范圍內(nèi)延續(xù)可調(diào)，范圍內(nèi)延續(xù)可調(diào)，制備型能到達(dá)制備型能到達(dá)100ml/min。輸出壓力高，普通可高達(dá)輸出壓力高，普通可高達(dá)400500 kg/cm2。液缸容積小，適于梯度洗脫。液缸容積小，適于梯度洗脫。密封性好，耐腐蝕。密封性好，耐腐蝕。輸液泵類型輸液泵類型1 螺旋注射泵螺旋注射泵2 往復(fù)柱塞泵往復(fù)柱塞泵3 往復(fù)隔膜泵往復(fù)隔膜泵4 氣動(dòng)放大泵氣動(dòng)放大泵目前運(yùn)用最多的是柱塞往復(fù)泵。目前運(yùn)用最多的是柱塞往復(fù)泵。泵的運(yùn)用與維護(hù)泵的運(yùn)用與維護(hù)v 防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因此應(yīng)過濾流動(dòng)相。防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因此應(yīng)過濾流動(dòng)

18、相。v 流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)停泵過夜或保管在泵內(nèi)更長(zhǎng)時(shí)間。必需泵入純水將泵充應(yīng)停泵過夜或保管在泵內(nèi)更長(zhǎng)時(shí)間。必需泵入純水將泵充分清洗后，再換成適宜于保管色譜柱和有利于泵維護(hù)的溶分清洗后，再換成適宜于保管色譜柱和有利于泵維護(hù)的溶劑。劑。v 防止流動(dòng)相耗盡空泵運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致柱塞磨損、缸體或密封損防止流動(dòng)相耗盡空泵運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致柱塞磨損、缸體或密封損v 壞，最終產(chǎn)生漏液。壞，最終產(chǎn)生漏液。v 輸液泵的任務(wù)壓力不能超越規(guī)定的最高壓力，否那么會(huì)使高輸液泵的任務(wù)壓力不能超越規(guī)定的最高壓力，否那么會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液壓密封環(huán)變

19、形，產(chǎn)生漏液(40 MPa, 400 bar, 5800 psi)。v 流動(dòng)相應(yīng)脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，流動(dòng)相應(yīng)脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，假設(shè)有大量氣泡，泵就無法正常任務(wù)。假設(shè)有大量氣泡，泵就無法正常任務(wù)。單流路真空脫氣安裝的原理單流路真空脫氣安裝的原理高壓梯度安裝構(gòu)造四元低壓梯度系統(tǒng)構(gòu)造合。合。4.進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)v 作用：將試樣引入色譜柱作用：將試樣引入色譜柱v 位置：在高壓泵和色譜柱之間位置：在高壓泵和色譜柱之間v 類型：手動(dòng)或自動(dòng)類型：手動(dòng)或自動(dòng)v 進(jìn)樣器：六通閥進(jìn)樣器：六通閥 進(jìn)樣器進(jìn)樣器 手動(dòng)手動(dòng) 經(jīng)注射器進(jìn)樣經(jīng)注射器進(jìn)樣自動(dòng)自動(dòng) 六通閥六通閥

20、 圓盤式自動(dòng)進(jìn)樣器圓盤式自動(dòng)進(jìn)樣器 鏈?zhǔn)阶詣?dòng)進(jìn)樣器鏈?zhǔn)阶詣?dòng)進(jìn)樣器六通閥手動(dòng)進(jìn)樣器原理表示圖六通閥手動(dòng)進(jìn)樣器原理表示圖 Load Inject 手動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器v 用微量注射器將樣品溶液注入六通閥用微量注射器將樣品溶液注入六通閥v 留意必需運(yùn)用留意必需運(yùn)用HPLC公用平頭微量注射器，不能運(yùn)用氣公用平頭微量注射器，不能運(yùn)用氣相色譜尖頭微量注射器，否那么會(huì)損壞六通閥。相色譜尖頭微量注射器，否那么會(huì)損壞六通閥。v 進(jìn)樣方式：有部分裝液法和完全裝液法進(jìn)樣方式：有部分裝液法和完全裝液法自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器v 由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制進(jìn)樣六通閥、計(jì)量泵和進(jìn)樣針的位由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制進(jìn)樣六通閥、計(jì)量泵和進(jìn)樣針的位置

21、，按預(yù)先編制的進(jìn)樣操作程序任務(wù)，自動(dòng)完成定量置，按預(yù)先編制的進(jìn)樣操作程序任務(wù)，自動(dòng)完成定量取樣、洗針、進(jìn)樣、復(fù)位等過程。取樣、洗針、進(jìn)樣、復(fù)位等過程。 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。 柱管資料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合資料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。 普通色譜柱長(zhǎng)530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 以上。 普通在分別前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分別柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分別柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分別柱的性能不受影響。 柱子裝填得好壞

22、對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料20m普通采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，普通采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。經(jīng)沖洗后，即可備用。 普通柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑普通柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)540 cm。開展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。開展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。柱溫箱柱溫箱v 用于使色譜柱恒溫的安裝，普通其控溫范圍高于室溫，也用于使色譜柱恒溫的安裝，普通其控溫范圍高于室

23、溫，也可低于室溫，通?？刂浦鶞卦诳傻陀谑覝兀ǔ？刂浦鶞卦?040。有些柱溫箱還。有些柱溫箱還具有柱切換安裝。具有柱切換安裝。v 色譜柱的任務(wù)溫度對(duì)保管時(shí)間、相對(duì)保管時(shí)間、溶劑的溶色譜柱的任務(wù)溫度對(duì)保管時(shí)間、相對(duì)保管時(shí)間、溶劑的溶解才干、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。普通升解才干、色譜柱的性能、流動(dòng)相的粘度都有影響。普通升高柱溫，可添加組分在流動(dòng)相中的溶解度，減小分配系數(shù)高柱溫，可添加組分在流動(dòng)相中的溶解度，減小分配系數(shù)K，縮短分析時(shí)間；還可降低流動(dòng)相的黏度，降低柱壓與，縮短分析時(shí)間；還可降低流動(dòng)相的黏度，降低柱壓與提高柱效。提高柱效。 1 1紫外紫外- -可見吸收檢測(cè)器可見吸收檢測(cè)器U

24、V-VisUV-Vis： 適用于吸收紫外或可見光的物質(zhì)適用于吸收紫外或可見光的物質(zhì) 靈敏度較高，運(yùn)用范圍較廣靈敏度較高，運(yùn)用范圍較廣 ( (光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器DAD)DAD) 2 2熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器FLDFLD： 只能分析具有熒光活性的物質(zhì)只能分析具有熒光活性的物質(zhì) 靈敏度高，但適用范圍有限靈敏度高，但適用范圍有限 3 3示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器RIDRID： 利用折光率的差別來檢測(cè)，為通用型利用折光率的差別來檢測(cè)，為通用型 檢測(cè)器，但靈敏度低，溫度要求嚴(yán)厲檢測(cè)器，但靈敏度低，溫度要求嚴(yán)厲 4 4電化學(xué)檢測(cè)器：電化學(xué)檢測(cè)器： 常用的有電導(dǎo)檢測(cè)器和安培檢測(cè)器常用的有

25、電導(dǎo)檢測(cè)器和安培檢測(cè)器 電導(dǎo)檢測(cè)器是丈量物質(zhì)在流動(dòng)相中電離后所引起電導(dǎo)檢測(cè)器是丈量物質(zhì)在流動(dòng)相中電離后所引起的電導(dǎo)率的變化，組分濃度越高，電離產(chǎn)生的離的電導(dǎo)率的變化，組分濃度越高，電離產(chǎn)生的離子濃度越高，電導(dǎo)率變化就越大，多用于離子色子濃度越高，電導(dǎo)率變化就越大，多用于離子色譜。譜。 安培檢測(cè)器適用于測(cè)定一切在任務(wù)電極的電壓范安培檢測(cè)器適用于測(cè)定一切在任務(wù)電極的電壓范圍內(nèi)發(fā)生氧化或復(fù)原反響的物質(zhì)，在生化樣品分圍內(nèi)發(fā)生氧化或復(fù)原反響的物質(zhì)，在生化樣品分析中運(yùn)用廣泛，是迄今最靈敏的析中運(yùn)用廣泛，是迄今最靈敏的HPLCHPLC檢測(cè)器。檢測(cè)器。5 5其他檢測(cè)器其他檢測(cè)器 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器等化

26、學(xué)發(fā)光檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器等HPLC分析根本操作分析根本操作v 1預(yù)備：流動(dòng)相配制、脫氣，樣品制備。預(yù)備：流動(dòng)相配制、脫氣，樣品制備。v 2開機(jī)：依次翻開計(jì)算機(jī)、泵、檢測(cè)器、柱溫箱電源開開機(jī)：依次翻開計(jì)算機(jī)、泵、檢測(cè)器、柱溫箱電源開關(guān)，儀器自檢。關(guān)，儀器自檢。v 3裝柱：將吸液頭插入曾經(jīng)過濾和脫氣處置的甲醇中，裝柱：將吸液頭插入曾經(jīng)過濾和脫氣處置的甲醇中，開啟泵，使液體流出，調(diào)流速在開啟泵，使液體流出，調(diào)流速在0.2mL/min，銜接色譜柱，銜接色譜柱留意方向，待液體流出色譜柱后，再與檢測(cè)器銜接。留意方向，待液體流出色譜柱后，再與檢測(cè)器銜接。v 4平衡：升高流速常規(guī)分析柱普通至平衡：升高流速常規(guī)分析柱普通至1 mL/min，大約大約15min后，換上預(yù)備的流動(dòng)相假設(shè)流動(dòng)相含鹽或后，換上預(yù)備的流動(dòng)相假設(shè)流動(dòng)相含鹽或甲醇比例較低，中間需適當(dāng)過渡，待基線走穩(wěn)。甲醇比例較低，中間需適當(dāng)過渡，待基線走穩(wěn)。v 5儀器面板或色譜任務(wù)站設(shè)置分析條件，如設(shè)置泵參儀器面板或色譜任務(wù)站設(shè)置分析條件，如設(shè)置泵參數(shù)：任務(wù)